桑叶提取物DNJ对HFD小鼠的抗肥胖作用研究
时间：2021-01-16 14:07:46 来源：达达文档网 本文已影响 人 
李晴晴 王妍 刘灿 唐艺榕
目的：探讨桑叶提取物DNJ对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的抗肥胖作用。
方法：建立C57/BL小鼠鼠肥胖症模型，给药不同剂量DNJ干预。
实验分组为：空白对照组，HFD模型组，给药低剂量DNJ（50mg·kg-1·d-1）组，给药高剂量DNJ（100mg·kg-1·d-1）组。检测小鼠体重、附睾白色脂肪、肩胛棕色脂肪重量；
白色脂肪HE染色观察形态学变化；
检测棕色脂肪组织UCP1 和 PRDM16 表达。
结果：（1）DNJ抑制HFD肥胖小鼠体重增加，改善由高脂饮食导致的白色脂肪组织过量积累，增加棕色脂肪量；
（2）DNJ能够改善因高脂饮食而造成的附睾脂肪组织细胞增大。（3）DNJ能够棕色脂肪特异性基因的表达，提高HFD小鼠棕色脂肪活性。
结论：桑叶提取物DNJ对HFD小鼠具有抗肥胖的作用，其抗肥胖作用可能与增强棕色脂肪活性有关。
关键词：肥胖；
DNJ；
白色脂肪；
棕色脂肪
随着社会的发展与人们生活方式的改变，超重和肥胖人群逐渐增多。大量研究表明，肥胖已成为糖尿病、高脂血症、高血压等疾病的危险因素。对于肥胖的预防与治疗手段主要包括饮食控制、药物治疗和手术治疗等。哺乳动物体内主要存在两种脂肪，白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪以储能为主，分化异常或过度堆积诱发肥胖。棕色脂肪产热耗能，起到保暖及维持机体热平衡的作用，增强机体棕色脂肪活性可有效对抗肥胖。
桑叶是传统中医治疗常用的中药材，富含多种活性物质，如：黄酮、生物碱、多糖、氨基酸及多种维生素、微量元素等，具有降血糖、调血脂、抗炎抗氧化的功效。1-脱氧野尻霉（1-Deoxynojirimycin， DNJ）是从桑叶中分离出的一个哌啶类多羟基生物碱。关于桑叶的研究多集中在降血糖及其机理方面，对肥胖的治疗作用鲜有报道。本课题以高脂饲料诱导的肥胖模型小鼠为实验动物，给药DNJ，探讨其对肥胖的治疗作用，为充分开发利用桑叶DNJ的生物活性功能提供理论依据。
1. 材料
1.1 实验动物
C57/BL 雄性小鼠，4周龄，SPF级，购自湖南斯莱克实验动物有限公司，体重（15-20）g（质量合格证号：NO.4845700029），购入后饲养于长沙医学院动物实验中心。标准环境喂养（室温：22±2℃；
相对湿度：55%±10%），光照为12小时/天，给予小鼠自由饮水和饮食。
1.2 试剂
DNJ（纯度98%，北京世纪奥科生物技术有限公司）， 胆固醇、胆酸钠（美国Amresco公司），蛋黄粉（瑞士雀巢食品公司）。普通饲料购自长沙医学院动物实验中心。甲醛溶液（福尔马林，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
石蜡 （湖南明瑞科技有限公司），二甲苯（国药集团化学试剂有限公司），HE染色试剂盒（南京雨露生物有限公司）。UCP1、PRDM16单克隆抗体，β-actin单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。UCP1、PRDM16引物由上海生工生物有限公司设计并合成。蛋白提取试剂（碧云天生物公司），RNA提取试剂、逆转录试剂盒、SYBR Real-time PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）。
2. 方法
2.1 小鼠肥胖模型的建立
C57/BL小鼠45只，普通饲料喂养1周后，随机分为空白对照组（n=10）和造模組（n=35）。空白对照组普通饲料喂养，造模型组高脂饲料（基础饲料78.9%，猪油10%，蛋黄粉10%，胆固醇1%，胆酸钠盐0.1%）饲养。自由饮食饮水，保持通风，相对湿度为55%±10%，温度为（22±2）℃，昼夜节律照明。连续饲养8周，体重增加20%以上的小鼠即为肥胖模型小鼠。
2.2 实验分组
C57/BL肥胖模型小鼠33只随机分为3组：肥胖模型组（HFD组），DNJ低剂量组（50mg/kg/d），DNJ高剂量（100mg/kg/d），灌胃给药，连续给药4周。给药结束禁食12 h后处理。
2.3 指标检测
2.3.1 脂肪组织收集
所有动物处理前禁食过夜，称重，10%水合氯醛腹腔注射（100μL/10g） 麻醉，收集动物睾丸周围白色脂肪组织、肩胛部位棕色脂肪，准确称重。取少量新鲜附睾脂肪，用10%甲醛溶液固定，其余组织经液氮快速冷冻后-80℃保存备用。
2.3.2 附睾脂肪组织HE染色
经10%甲醛溶液固定24h的脂肪组织，逐级脱水、透明、浸腊、包埋、切片，HE染色后，于高分辨率显微镜下观察并拍照。
2.3.3 Real-time PCR棕色脂肪组织中UCP1、PRDM16 mRNA表达
取棕色脂肪组织，每100mg组织加入约1ml裂解液充分裂解，并进行液氮冰浴研磨处理。将研磨后的组织震荡混匀，室温静置后，4℃12000rpm离心5min，转移上清液EP管中提取RNA。
将提取好的RNA按照逆转录试剂盒的操作说明，逆转录为cDNA。逆转录所得cDNA稀释25倍，以2μL cDNA为模板，β-actin为内参，荧光定量PCR仪进行PCR扩增基因片断反应，通过△△Ct值相对定量UCP1、PRDM16mRNA表达。引物序列表如表1所示。
2.3.4 Western blot 法检测 UCP1 和PRDM16 表达
取棕色脂肪匀浆后，4℃条件下，12000rpm离心10min，上清分装转移至0.5mL的离心管中。加入适量的含0.1%PMSF（蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟）的Western IP裂解液冰浴裂解30min，收集上清液，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液，99℃变性10min。每组以含总蛋白40g上样，电泳分离后转移至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上用5%脱脂奶粉封闭1h，然后与一抗于4℃孵育过夜，用TBST洗涤后， 再与二抗孵育1h，用TBST洗涤后显影并定量分析。
2.4 统计学方法
实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS19.0软件进行t检验。差异显著水平为 P< 0.05。
3. 实验结果
3.1 DNJ抑制HFD肥胖小鼠体重的增加
为研究桑叶提取物DNJ的抗肥胖作用，本实验用高脂饲料喂养小鼠建立肥胖模型。与普通饲料喂养的Control 组小鼠比较，高脂饲料饲养8周后模型组小鼠体重增加34.6%。
对造模成功的HFD肥胖小鼠，给药不同剂量DNJ治疗4周后，结果如图1显示：与肥胖模型组小鼠相比：低剂量DNJ组（50mg/kg/d）、高剂量DNJ组（50mg/ kg/d）小鼠体重均降低（图1a），附睾部位白色脂肪亦明显减少（图1b）；
与正常饮食组小鼠比较，HFD小鼠棕色脂肪量显著下降，不同剂量DNJ组小鼠棕色脂肪重量则显著增加（图1c）。由此知DNJ能够改善由高脂饮食导致的小鼠白色脂肪组织的积累，增加棕色脂肪量，抑制HFD肥胖小鼠体重的增加。
3.2 DNJ抑制HFD肥胖小鼠白色脂肪细胞的增大
白色脂肪以储能为主，过度积累是肥胖的重要表征，可表现为脂肪细胞体积的增大和数量的增多。给予小鼠高脂饮食后，附睾部位脂肪累积增多。附睾白色脂肪形态学HE染色结果如图2所示，与Control 组相比，HFD组脂肪细胞形态增大。给药不同剂量DNJ（50mg/kg/d、100mg/kg/d）治疗后，附睾白色脂肪的大小则明显缩小。此结果表明DNJ可改善因高脂饮食而造成的附睾脂肪组织的细胞增大。
3.3 DNJ提高HFD肥胖小鼠棕色脂肪活性
通过对小鼠棕色脂肪特异性基因UCP1、PRDM16的表达量进行检测，结果如图3所示。HFD肥胖小鼠棕色脂肪UCP1、PRDM16表达均低于普通饮食组小鼠，但无统计学意義。而肥胖组小鼠经DNJ治疗后，UCP1、PRDM16 mRNA表达显著增加（图3a、图3b）。进一步对蛋白表达检测显示：棕色脂肪中UCP1、PRDM16 蛋白表达亦显著增加（图3c、图3d）。由此知DNJ可上调棕色脂肪特异性基因的表达，提高棕色脂肪组织产热活性，从而发挥抗肥胖作用。
4. 讨论
肥胖是由于白色脂肪分化或代谢异常诱发的一种代谢性疾病，已是多种心脑血管疾病的诱发因素之一。当饮食中摄入的脂肪增加时，肥胖的发生率也随之增加。因此，寻找安全有效的治疗方法具有非常重要的意义。棕色脂肪作为产热脂肪，可通过高表达UCP1（解偶联蛋白），促进线粒体解耦联呼吸作用，使机体多余能量以热能形式释放。提高棕色脂肪产热活性可作为一种潜在的治疗肥胖的有效手段。
1-脱氧野尻霉（DNJ）作为桑叶中的主要活性成分之一，可显著抑制α-葡萄糖苷酶活性而有效降低血糖。
Tsuduki T等研究发现，DNJ可降低肥胖小鼠内脏脂肪量和细胞大小，但其抗肥胖机理目前并未阐明。我们的前期研究结果显示：DNJ可通过抑制3T3-L1白色脂肪分化成熟并促进其向棕色脂肪分化而发挥抗肥胖效应。本课题以HFD诱导的肥胖模型小鼠作为实验对象，给药低剂量 DNJ（50mg/kg/d）、高剂量DNJ（50mg/kg/d）4周后，DNJ可有效抑制体重的增加，附睾部位脂肪细胞大小亦明显小于HFD肥胖组小鼠，这一结果与文献报道一致，即DNJ能够改善因高脂饮食而造成的附睾组织的脂肪细胞增大，抑制HFD肥胖小鼠体重的增加。但50mg/kg/d、100mg/kg/d两个不同剂量组的作用并无明显差别。
为进一步探究DNJ抑制肥胖小鼠体重增加的作用是否与调控棕色脂肪活性有关，本课题对小鼠肩胛部位棕色脂肪特异性基因检测发现，与正常饮食小鼠相比，HFD组小鼠UCP1、PRDM16基因的表达有所降低，说明高脂饮食可能损伤棕色脂肪发育。与HFD组小鼠比较，低剂量DNJ组及高剂量DNJ组小鼠UCP1、PRDM16基因的mRNA及蛋白表达均显著升高。此结果说明DNJ可通过增强棕色脂肪组织活性，发挥抵抗高脂饮食诱导的肥胖作用。
通过以上结果可知：桑叶提取物DNJ具有抑制HFD小鼠体重增加的抗肥胖作用，这一作用与增强棕色脂肪活性有关，而具体的机制还需进一步的深入研究。
基金项目：
湖南省教育厅优秀青年项目（编号17B036）；
湖南省教育厅科学研究项目（编号：17A026、18A497）；
新型药物制研发湖南省重点实验室（ 2016TP1029〕；
2014 年湖南省校企合作人才培养示范基地项目（ 湘教通[2014] 272 号）
作者简介：
李晴晴（1989-），女，汉族，安徽宿州人，研究生，讲师，研究方向：肥胖及代谢性疾病药理；
王妍（1999-），女，汉族，湖南永州人，药物制剂专业在读本科生；
刘灿（1999-），女，汉族，湖南株州人，药物制剂专业在读本科生；
唐艺榕（1999-），女，湖南怀化人，汉，药物制剂专业在读本科生。
