分泌型卷曲相关蛋白1与慢性牙周炎的相关分析

袁海波　金晶　许春姣等

[摘要] 目的 检测分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）在慢性牙周炎（CP）患者和牙周健康者的表达情况，探讨SFRP1在CP的发生与发展过程中的作用。方法 选择CP患者28例为试验组，按临床附着丧失（CAL）程度分为轻、中、重度3组，另外选择牙周健康者10例为对照组。收集两组研究对象的龈沟液，采用酶联免疫吸附法测定龈沟液中SFRP1的质量浓度。取试验组中22例CP患者的病变牙龈组织标本，以及10例对照组的正常牙龈组织，进行SFRP1免疫组织化学染色，观察着色强度，分析SFRP1表达与不同程度CP的相关性。结果 1）试验组和对照组龈沟液中SFRP1的质量浓度分别为（281.07±33.37）和（245.30±35.69）ng·L-1，试验组明显高于对照组（P<0.05）；
龈沟液内SFRP1质量浓度与CAL呈明显正相关（r=0.651，P<0.001）。2）试验组SFRP1着色强度积分值（4.500±0.913）明显高于对照组（2.800±1.135）（P<0.001）；
试验组中，轻、中、重度CP组间的着色强度积分值无明显差异（P>0.05）。结论 SFRP1在CP患者龈沟液及牙龈组织中的表达高于牙周健康者，SFRP1可能参与了CP的发生发展过程。

[关键词] 慢性牙周炎；

龈沟液；

分泌型卷曲相关蛋白1

[中图分类号] R 783.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.017

分泌型卷曲相关蛋白1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）是一种分泌型糖蛋白，是Wnt信号通路的重要拮抗剂。Wnt信号通路能影响人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）的成骨分化调节骨生成和改建[1-2]，由此推测，SFRP1与慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）可能存在密切关系。本研究通过检测CP患者龈沟液中SFRP1的水平及病变牙龈组织中SFRP1的表达，探讨SFRP1在CP发生中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料与研究对象

SFRP1酶联免疫分析试剂盒（R&D;公司，美国），SFRP1兔抗人、鼠多克隆抗体（Abcam公司，美国），通用型Streptavidin-HRP试剂盒、免疫组织化学DAB显色剂（北京康为世纪生物科技有限公司）。

实验对象均取自2011年3—12月在中南大学湘雅医院口腔科就诊的患者，选择CP患者28例为试验组，牙周健康者10例为对照组。CP患者按照临床附着丧失（clinical attachment loss，CAL）分为3度：轻度CP患者9例，CAL为1～2 mm；
中度CP患者10例，CAL为3～4 mm；
重度CP患者9例，CAL≥5 mm。试验组与对照组年龄、性别均匹配。所有研究对象均了解本次研究目的，同意参与并配合试验，全身健康状况良好，并符合以下要求：1）无糖尿病、心血管疾病、类风湿疾病等全身系统性疾病，无其他系统感染；
2）近半年内未接受过牙周治疗，近3个月内未服用过抗生素、免疫抑制剂等药物；
3）女性未处于妊娠期、哺乳期、月经期；
4）咬合关系正常，无正畸治疗史；
5）无长期吸烟和酗酒史。

1.2 试验方法

1.2.1 SFRP1在龈沟液中的质量浓度 用专用标准滤纸条采集研究对象的龈沟液。采集部位为右下颌第一磨牙的龈沟或牙周袋内6个位点（颊侧远中、颊侧中央、颊侧近中，舌侧远中、舌侧中央、舌侧近中）。检测所有研究对象的牙周临床指标，包括牙周探诊深度（probing depth，PD）、CAL、龈沟出血指数（bleeding index，BI）。采用酶联免疫吸附法测定龈沟液中SFRP1的质量浓度。

1.2.2 SFRP1在牙周组织中的表达 手术中取22例CP患者的病变牙龈组织（轻、中、重度CP组分别为7、7、8例），10例对照组取手术切取的正常牙龈组织，固定包埋，切片，按照标准二步法进行SFRP1免疫组织化学染色，显微镜下观察并照相。SFRP1在牙龈组织中的表达使用着色强度积分进行评价[3]，以有棕黄色颗粒状沉淀为阳性细胞，着色范围以阳性细胞记分。阳性细胞所占比例≤1%记为0分，2%～

20%为1分，21%～50%为2分，≥50%为3分；
着色程度依据深浅记分，无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分。上述两项分值相加为着色强度积分值：≤1.9分为阴性（-），2～2.9分为弱阳性（+），3～3.9分为阳性（++），≥4分为强阳性（+++）。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。采用方差分析和LSD法分析各组龈沟液内SFRP1的质量浓度；
Spearman相关分析法分析龈沟液内SFRP1质量浓度与CAL的关系；
采用独立样本t检验、方差分析、Tukey分析法分析各组牙龈组织中SFRP1的表达。

2 结果

2.1 SFRP1在龈沟液中的质量浓度

2.1.1 CP组与对照组龈沟液中SFRP1质量浓度比较 经独立样本t检验，CP组龈沟液的量及SFRP1质量浓度明显高于对照组（P<0.05）（表1）。

2.1.2 各组龈沟液中SFRP1质量浓度多重比较 轻、中、重度CP组的SFRP1质量浓度分别为（250.42±19.48）、（285.70±21.29）、（306.57±32.50）ng·L-1。轻度CP组与对照组、中度CP组与重度CP组之间龈沟液中SFRP1的质量浓度无明显差异（P>0.05）；
其余各组间两两比较均有统计学意义，轻度CP组明显低于中度和重度组，同时，中度和重度CP组明显高于对照组，其差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.1.3 SFRP1质量浓度与CAL的关系 经Spearman相关分析，龈沟液内SFRP1质量浓度与CAL呈正相关关系（图1，r=0.651，P<0.001）。

2.2 SFRP1在牙龈组织中的表达

2.2.1 SFRP1在各组中的表达形态学特点 在正常的牙龈组织中，SFRP1的表达集中在上皮细胞，且棕黄色颗粒多沉积在细胞质中（图2A）；
上皮下结缔组织中少有染色，偶见成纤维细胞有阳性表达（图

2B）。在慢性牙周炎牙龈中，SFRP1的表达较多，染色也较深，其上皮层的表达相对于对照组表达范围更为广泛，程度更深；
上皮下结缔组织中的表达对比明显，SFRP1高表达于成纤维细胞、单核细胞、内皮细胞等（图2C、D、E）。

2.2.2 SFRP1在牙龈组织中表达情况的分析 CP组和对照组的SFRP1表达强度见表2。在22例CP病例的牙龈组织中，SFRP1的表达阳性率为100%（22/22），强阳性表达率为77.27%（17/22）；
10例对照组中，SFRP1的表达阳性率为80.00%（8/10），强阳性表达率为30.00%（3/10）；
CP组和对照组的着色强度积分值分别为4.500±0.913和2.800±1.135，二者差异有统计学意义（P<0.001）。

由表3可见：经单因素方差分析，各组间整体比较其差异有统计学意义（F=7.859，P=0.01），进一步采用Tukey法进行组间两两比较，发现除对照组与中度、重度CP之间的差异有统计学意义外（P<0.05），其余组间的差异无统计学意义。

3 讨论

在慢性牙周炎的发病过程中，宿主对牙周致病微生物感染的初步应答是激活免疫系统并引发局部炎症反应，其后释放一系列细胞因子和其他调节因子，炎症反应扩散，从而波及到邻近的结缔组织和牙槽骨，导致牙周组织破坏。研究[4-5]表明，在疾病发展过程中，基质金属蛋白酶（matrix metallopro-teinases，MMPs）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等蛋白酶和炎症介质发挥着调节作用。Ma等[6]的研究显示，在人软骨细胞中，IL-1β通过一个负反馈回路影响Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介导的MMPs的表达。Heo等[2]发现，经典Wnt/β-catenin通路能影响人PDLCs的成骨分化，Wnt促进剂氯化锂能够促进人PDLCs的增殖分化。这些研究提示Wnt信号通路可能参与了牙周炎的发展过程。

SFRP1是分泌型卷曲相关蛋白家族中的一员，为Wnt信号通路的重要拮抗剂。本研究发现，SFRP1在慢性牙周炎的龈沟液中的质量浓度以及在牙周组织中的表达均高于正常对照组，且有随慢性牙周炎的严重程度增加而增加的趋势，提示SFRP1与慢性牙周炎的发生进展相关。

3.1 SFRP1在龈沟液中的质量浓度

龈沟液是宿主内外环境交汇的一个微环境，其成分发生变化能客观地提示宿主的牙周状态。Hanio-ka等[7]发现，牙周炎患者龈沟液中PGE2、TNF-α、IL-l、IL-8等炎症因子的浓度高于健康者，从而认为这些炎症因子可以作为牙周炎的监控指标。目前，对于SFRP1在牙周炎中的研究还较少。本试验发现，SFRP1在CP患者龈沟液中的质量浓度明显高于正常对照组，提示SFRP1在炎症状态的牙周组织的质量浓度较高。进一步比较轻、中、重度CP及正常对照组，说明SFRP1的质量浓度在正常牙周状态或轻度CP进展到中度或重度CP过程中发生了变化。本试验Spearman相关分析表明，龈沟液内SFRP1质量浓度与CAL呈正相关，进一步提示SFRP1的质量浓度与慢性牙周炎牙槽骨破坏的严重程度密切相关。

3.2 SFRP1在牙龈组织中的表达

在牙周炎发展的过程中涉及到骨代谢的改变，而Wnt信号通路对骨代谢有着重要的影响。Wnt信号通路的激活能促进成骨，在骨中高表达Wnt信号通路受体低密度脂蛋白受体相关蛋白-5（low-density lipoprotein receptor-related protein-5，LRP-5）功能突变体转基因小鼠，或缺乏Wnt拮抗剂SFRP1分泌的小鼠，表现出骨矿化密度升高和抑制成骨细胞凋亡[1]；
而LRP-5突变可导致骨矿化密度降低及骨折。Bodine等[8]证实，通过敲除小鼠Wnt信号拮抗剂SFRP1，能延长和增强小鼠骨小梁的生长，SFRP1的缺失能够降低成骨细胞和骨细胞的凋亡，同时增强这些细胞的增殖和分化。

DKK1作为Wnt信号通路的抑制剂，在抑制骨质形成的同时促进骨质破坏，在骨代谢中发挥着重要的作用[9]。Heo等[2]研究了氯化锂和DKK1对PDLCs的作用，发现Wnt促进剂氯化锂能够促进PDLCs的增殖分化，而其拮抗剂DKK1的作用则相反。Li等[10]在研究牙龈卟啉单胞菌诱导形成的牙周炎小鼠模型中发现，炎症细胞、成纤维细胞及骨细胞中SFRP1的表达明显高于对照组；
在实验组加入SFRP1抗体，另一组加入IgG抗体作为对照，可以发现实验组上皮萎缩和附着丧失显著低于对照组，破骨细胞、中性粒细胞、单核白细胞计数也低于对照组。由此可见，抑制SFRP1的表达能够降低牙周组织的破坏，减少炎症浸润，降低破骨细胞数量。

本研究发现，SFRP1在牙周炎及正常牙龈组织中均有表达，但在慢性牙周炎中的表达程度更高；
从正常牙周状态进展到中度或重度慢性牙周炎过程中，牙龈组织中的SFRP1质量浓度发生了变化，提示SFRP1参与了牙周炎的发展过程。

[参考文献]

[1]Bodine PV. Wnt signaling control of bone cell apoptosis[J]. Cell Res， 2008， 18（2）：248-253.

[2]Heo JS， Lee SY， Lee JC. Wnt/β-catenin signaling enhances osteoblastogenic differentiation from human periodontal ligament fibroblasts[J]. Mol Cells， 2010， 30（5）：449-454.

[3]许良中， 杨文涛. 免疫组织化学反应结果的判断标准[J]. 中国癌症杂志， 1996， 6（4）：229-231.

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[6]Ma B， van Blitterswijk CA， Karperien M. A Wnt/β-catenin negative feedback loop inhibits interleukin-1-induced matrix metalloproteinase expression in human articular chondro-cytes[J]. Arthritis Rheum， 2012， 64（8）：2589-2600.

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[8]Bodine PV， Zhao W， Kharode YP， et al. The Wnt antagonist secreted frizzled-related protein-1 is a negative regulator of trabecular bone formation in adult mice[J]. Mol Endocrinol， 2004， 18（5）：1222-1237.

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[10]Li CH， Amar S. Inhibition of SFRP1 reduces severity of periodontitis[J]. J Dent Res， 2007， 86（9）：873-877.

（本文编辑 吴爱华）