中国人群慢性牙周炎患者龈下菌斑中的细菌群落结构分析

李沫 沈陆 漆正楠 唐子圣 秦胜营

摘 要 为确定6名中国慢性牙周炎患者龈下菌斑的细菌群落结构，将扩增的菌斑中的细菌16S rDNA序列克隆到大肠杆菌.测序后对323条可鉴定的克隆序列进行分析，发现龈下细菌群落主要由6种细菌门类组成，而细菌属类的分布差异较大.这为提高慢性牙周炎发病机制的认识、提供更多的有效预防和治疗措施提供参考.

关键词 中国人群；
牙周疾病；
慢性牙周炎；
牙菌斑；
16S rDNA

中图分类号 Q939.93文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）06-0040-04

Abstract The purpose of this study was to determine the bacterial composition of human subgingival plaque in 6 Chinese chronic periodontitis patients and provide related bacterial distribution information. Amplified bacterial 16S rDNA sequences are cloned into Escherichia coli. After sequencing， 323 identified cloned sequences are analyzed， the subgingival microbial community mainly consisted of 6 bacterial phyla. However the proportions of bacterial genera in the subgingival plaque samples are different. This study provides the basis for raising awareness of the pathogenesis of chronic periodontitis and providing more effective prevention and treatment.

Key words Chinese；

periodontal disease；

chronic periodontitis；

dental plaque；

16S Ribosomal DNA

牙周炎是牙周组织的一种慢性感染性疾病，是口腔两大类主要疾病之一，在国内外均有较高的患病率.目前大量研究显示宿主对微生物不恰当的免疫反应是造成牙周组织破坏的主要原因.然而，由細菌感染引起的慢性牙周炎的详细病理机制仍然不完全清楚[1].研究显示一些革兰氏阴性细菌类群在牙周疾病中发挥着重要的作用[2]，微生物群落结构可能与牙周疾病的发病机制有关[3].因此，准确了解病原体微生物和宿主之间的相互作用关系首先需要了解牙周微生物群落信息[4].

尽管人类频繁接触不同种类细菌以及个体间潜在的传播，但每个人往往保持自己的牙周菌群结构，这表明牙周菌群个体差异可能受到遗传或环境因素的影响[5].有研究证实有些牙周疾病的发生在不同种族成员之间存在显著差异[6].然而，也许是由于这些研究中使用的样品数量有限，菌群的组成在个体、种族、群体的差异仍然不是完全清楚，特别是很少有研究提供有关中国慢性牙周炎患者的口腔菌群结构信息，而这对研究者认识牙周病发病机制很重要[3].

1 材料和方法

1.1 慢性牙周炎患者的收集及选择标准

选择6例慢性牙周炎患者，均就诊于上海交通大学医学院附属上海第九人民医院口腔内科，都是中国人血统，其中3名29～67岁女性患者，3名32～60岁男性患者.所有患者都签订书面知情同意书，并通过了上海第九人民医院的伦理委员会审核.

1.2 样品的采集与DNA的提取

分别在每位患者4个象限口选择4颗最深的牙周炎牙齿为样品，用气吹枪保持牙齿面干燥.清除掉牙齿表面的菌斑后，使用龈下刮治器获得龈下菌斑，然后把6个患者的样品分别放入装有1 mL PBS的1.5 mL离心EP管.10 000 r/min离心，去除上清液，-20 ℃保存.

使用Zoetendal[7]建立的“洗涤，冻融，珠打浆机，苯酚-氯仿” 方法提取DNA.取1 μL DNA溶液用0.8%琼脂糖凝胶电泳以检测DNA的纯度和完整性，剩余DNA溶液在-20 ℃冷冻保存.

1.3 PCR 扩增16S rDNA片段，并克隆

使用一对通用引物[8]在标准条件下进行16S rDNA扩增.PCR反应在ABI 9700热循环仪中进行.使用1U 的LA Taq聚合酶（Takara）（50 μL终体积）在热启动说明书指导下，将样品在95 ℃下预热8 min，随后在以下条件下扩增：变性95 ℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸1.5 min.共进行30个循环，随后在72 ℃延伸10 min.PCR扩增的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检查，DNA用溴化乙锭染色并在短波紫外线灯下观察.

使用TOPOTA克隆试剂盒（英杰公司）参照说明完成PCR扩增后DNA序列的克隆.将转化的细胞铺板到含有卡那霉素的Luria-琼脂培养基平板上并在37 ℃保温过夜.单菌落转到含40 μL 10 mmol/L Tris的1.5 mL离心管中.取1 μL作为模板，鉴定在PCR中是否插入正确的M13正向引物和反向引物.随后通过1%琼脂糖凝胶的电泳检测插入片段的大小.

1.4 16S rDNA测序与序列分析

使用ABI 3730 DNA测序仪、ABI循环测序试剂盒（Perkin-Elmer公司的测序试剂盒和罗氏诊断公司的Taq DNA聚合酶）对16S rDNA进行测序.正向测序引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列为GGTTACCTTGTTACGACTT.使用ABI 9700热循环仪94 ℃变性10 s，58 ℃退火并延伸4 min，共进行25个循环反应.

为鉴定种属关系，将插入物的序列与核糖体数据库项目（RDP）[9]和GenBank中的公共数据库进行比较.登录设置数据录入、编辑、序列比对、二级结构比较，相似矩阵生成使用DNAMAN软件进行（版本7.0）.使用Jukes和Cantor[10]的方法，对单一位置的多个碱基变化的相似矩阵进行了修正.

2 结果与分析

2.1 慢性牙周炎患者牙菌斑细菌中门类的多样性分析

6名慢性牙周炎患者牙菌斑细菌中分别克隆出50，39，76，56，71和44条序列，其中可鉴定序列323条.笔者发现患者牙菌斑细菌群落中最普遍的门类是：厚壁菌门（51.42%）、拟杆菌门（34.07%）、放线菌门（10.41%）、螺旋体门（2.21%）、变形菌（1.26%）和互养菌门（0.63%），如图1（彩图见封三）所示.虽然笔者在6名患者中总共鉴定出6种门类的细菌，但并不是所有患者都含有这6种门类细菌.有的门类只在个别患者中出现，比如：变形菌门只存在于A患者，互养菌门只在B和E患者中被发现.

每名慢性牙周炎患者龈下菌斑样中拟杆菌和厚壁菌门高比例分布，如表1所示.虽然每名患者牙菌斑细菌中都有较高比例的厚壁菌门，但也存在显著差异，其中E患者所占比率最高（73.2%）， A患者所占比率 （72%），B患者所占比率最低（28.2%）.有意思的是C患者在76个克隆鉴定出3种门类细菌，而B患者在39个克隆鉴定出5种门类细菌.这可能是取样偏差造成的，也可能说明菌群数量并不代表菌群的多样性.

2.2 慢性牙周炎患者牙菌斑細菌中属类的多样性分析

如图2（彩图见封三）所示，在属的水平上，6名慢性牙周炎患者中观察到高比例的放线菌门的放线菌属，拟杆菌门的卟啉单胞菌属、普氏菌属，厚壁菌门的链球菌和月形单胞菌属，为细菌总数量的80%以上，但不同患者之间细菌属类的分布比例存在较大的差异.另外，有些细菌属类在某个患者的牙菌斑中是独有的.

3 讨论

本实验对323条可鉴定的克隆序列进行分析，比较16S rDNA的数据库和双端测序结果，以超过98%的相似性作为鉴定标准，结果表明了慢性牙周炎患者的龈下菌斑中藏着一个高度多样化的细菌群落.在此之前，许多研究已经揭示牙周病的细菌微生物群落在不同地域人群中存在差异[11].然而，在中国人群中，很少有类似对中国牙周炎患者的研究报道.以往在中国牙周炎人群中的研究只关注一些特定的细菌菌株[12-13]，而本文则提供目前能确定的所有细菌门、属信息，并分析中国慢性牙周炎患者龈下菌斑的细菌群落结构.

Abusleme 等人对16S rDNA序列进行454-焦磷酸测序，报道了牙周炎群体分布较高比例的螺旋体门、互养菌门、厚壁菌门和绿弯菌门细菌；
而健康人携带较高比例的放线菌门特别是放线菌属，且均高于22名慢性牙周炎患者[14].而Adriana等用焦磷酸测序检查8名慢性牙周炎患者的16S rDNA基因文库[15]，在慢性牙周炎患者中找到的细菌主要门类为厚壁菌门（59%）、拟杆菌门（14%）和放线菌门（10%）.此外，通过Ion Torrent 16S rDNA基因扩增子测序，Junemann等人发现，在4份慢性牙周炎样品中最普遍的细菌门类为：拟杆菌门、厚壁菌门、梭菌属门、变形菌门、放线菌门、螺旋体门和互养菌门[16].通过与上述研究相比较，笔者发现不同的人群慢性牙周炎患者的龈下菌斑所带细菌在门类水平高度一致，然而门类水平的分布比例则差异较大.

Silva-Boghossian等人发现156 名慢性牙周炎患者所带韦永氏球菌属、侵肺类小杆菌属、福赛斯坦纳菌属和普氏菌属细菌的数量显著高于急性牙周炎患者，且在慢性牙周炎患者中还观察到高水平的放线菌、链球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌[17].另一项研究使用二代测序平台Miseq进行16S rDNA测序分析表明，健康者与牙周炎组相比所带细菌有39个菌属显著不同，而且患者组所带菌属和本研究结果几乎完全吻合[18].近期有项研究将慢性牙周炎患者按照探针出血指数分成两组，发现在分值较低组（均值≤50%）患者牙龈检出更多的韦永氏球菌、噬碳酸菌和TM7等，而分值较高组（均值>50%）患者牙龈下含有更多的真细菌、产线菌 、链球菌、福赛斯坦纳菌和密螺旋体属，几乎所有的菌类在本研究的样品中也可观察到[19].这些结果揭示了在慢性牙周炎患者中存在一些优势细菌属类，而且某些细菌属类的高比例分布可能与患者的严重程度相关.

4 结论

本研究结果表明，每个患者所带细菌的群落结构可能在门类水平保持一致，但在属类的水平上存在较大差异.本研究报道了中国6个慢性牙周炎患者龈下细菌群落的详细信息，对鉴定出的门类和属的比例进行了分析.有研究表明龈下微生物的动态变化可导致牙周炎，并建议临床监测龈下微生物作为疾病诊断和预后指标[20].但本研究样本量小，如果能招募更多的中国慢性牙周炎患者和健康对照受试者，将使我们进一步认识慢性牙周炎和细菌群落之间的关系，推进对中国慢性牙周炎患者的临床治疗.

参考文献：

[1] MALKOWSKA A， KASPRZAK A， STOPA J. Proinflammatory cytokines in pathogenesis of periodontal disease[J]. Pol Merkur Lekarski， 2006，20（115）：93-98.

[2] SOCRANSKY S S， HAFFAJEE A D. Microbial mechanisms in the pathogenesis of destructive periodontal diseases：
a critical assessment[J]. J Periodontal Res， 1991，26（3）：195-212.

[3] HAMLET S M， CULLINAN M P， WESTERMAN B， et al. Distribution of Actinobacillus actinomycetemcomitans， Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia in an Australian population[J]. J Clin Periodontol， 2001，28（12）：1163-1171.

[4] KROES I， LEPP P W， RELMAN D A. Bacterial diversity within the human subgingival crevice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1999，96（25）：14547-14552.

[5] MOORE W E C， MOORE L V H. The bacteria of periodontal diseases[J]. Periodontology 2000，1994，5（1）：66-77.

[6] SCHENKEIN H A， BURMEISTER J A， KOERTGE T E， et al. The influence of race and gender on periodontal microflora[J]. J Periodontol， 1993，64（4）：292-296.

[7] ZOETENDAL E G， HEILIG H G， KLAASSENS E S， et al. Isolation of DNA from bacterial samples of the human gastrointestinal tract[J]. Nat Protoc， 2006，1（2）：870-873.

[8] WEISBURG W G， BARNS S M， PELLETIER D A， et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J Bacteriol， 1991，173（2）：697-703.

[9] COLE J R， WANG Q， CARDENAS E， et al. The ribosomal database project：
improved alignments and new tools for rRNA analysis[J]. Nucleic Acids Res， 2009，37（S1）：D141-D145.

[10] JUKES T H， CANTOR C R. Evolution of protein molecules[J]. Mammalian Protein Metabolism， 1969，3（21）：132.

[11] DECAILLT F， GIANNOPOULOU C， CIONCA N， et al. Microbial profiles of patients seeking treatment for periodontitis. Influence of origin， smoking and age？[J]. Schweiz Monatsschr Zahnmed， 2012，122（3）：198-204.

[12] HE J， HUANG W， PAN Z， et al. Quantitative analysis of microbiota in saliva， supragingival， and subgingival plaque of Chinese adults with chronic periodontitis[J]. Clin Oral Investig， 2012，16（6）：1579-1588.

[13] DENG T， WANG L， LV J， et al. Association of three bacterial species and periodontal status in Chinese adults：
an epidemiological approach[J]. J Clin Microbiol， 2011，49（1）：184-188.

[14] ABUSLEME L， DUPUY A K， DUTZAN N， et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation[J]. ISME J， 2013，7（5）：1016-1025.

[15] ADRIANA L S， JOSE F S， ISABELA N R， et al. Comparing the bacterial diversity of acute and chronic dental root canal infections[J].PLoS One， 2011，6（11）：e28088.

[16] JUNEMANN S， PRIOR K， SZCZEPANOWSKI R， et al. Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by ion torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing[J]. PLoS One， 2012，7（8）：e41606.

[17] SILVA-BOGHOSSIAN C M， NEVES A B， RESENDE F A， et al. Suppuration-associated bacteria in patients with chronic and aggressive periodontitis[J]. J Periodontol， 2013，84（9）：e9-e16.

[18] LI Y， HE J， HE Z， et al. Phylogenetic and functional gene structure shifts of the oral microbiomes in periodontitis patients[J]. ISME J， 2014，8（9）：1879-1891.

[19] CAMELO-CASTILLO A， NOVOA L， BALSA-CASTRO C， et al. Relationship between periodontitis associated subgingival microbiota and clinical inflammation by 16S pyrosequencing[J]. J Clin Periodontol， 2015，42（12）：1074-1082.

[20] SHI B， CHANG M， MARTIN J， et al. Dynamic changes in the subgingival microbiome and their potential for diagnosis and prognosis of periodontitis[J]. MBio， 2015，6（1）：e01926-14.