[鼻渊舒口服液对急性鼻窦炎大鼠基因表达谱影响的实验研究] 鼻渊舒口服液 急性鼻窦炎
时间：2019-01-26 05:01:28 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要 目的：应用基因芯片技术研究鼻渊舒口服液对实验性急性鼻窦炎(ARS)大鼠基因表达谱的影响。方法：SD大鼠随机分为模型组、治疗组和正常组，模型组和治疗组依据Y.Gel的改良方法造模，正常组不做任何处理。造模成功后治疗组给予鼻渊舒口服液灌胃，处死动物，取鼻粘膜组织，选用Oligo-60S芯片，对鼻渊舒治疗ARS大鼠的差异表达基因谱进行初步研究和分析。结果：实验发现24条与鼻渊舒治疗作用直接相关的基因。其中PKC、Rgc32 protein、Acox2基因与鼻渊舒治疗ARS密切相关。结论：表明鼻渊舒口服液可以影响许多基因的表达，并从多途径、多环节、整体上调控炎症反应。
关键词 急性鼻窦炎 鼻渊舒口服液 大鼠 基因芯片 差异表达基因
急性鼻窦炎（ARS）是鼻窦粘膜的炎症性疾病，若急性期不及时治疗常迁延为慢性，严重影响患者健康。鼻渊舒口服液在临床已使用20余年，疗效确切。我们应用含5705条大鼠全长互补DNA的Ofigo-60S芯片，对鼻渊舒治疗ARS大鼠的差异表达基因谱进行初步研究和分析，为从基因组学水平阐明ARS的发病机制及中药治疗ARS的分子生物学机制提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料：鼻渊舒口服液(国药准字Z51020208，成都华神集团股份有限公司)；含5705条大鼠全长互补DNA的Oligo-60S芯片(生物芯片国家工程研究中心)；RNeasy mini spin column试剂盒(Qiagen公司)；金黄色葡萄球菌标准菌株(四川省卫生干部学院微生物教研室提供)等。
1．2 实验动物和造模方法：青年SD大鼠30只(四川大学华西医学实验动物中心提供，川实动管第70号)，200～250g，雌雄各半。按Ⅱ级生物安全标准无菌饲养1周后，参考相关文献［1］的方法，随机选取20只大鼠按0．5mg/kg腹腔注射氯胺酮全身麻醉，同时用利多卡因1．52～2．0ml(20mg／ml)配肾上腺素0．0125mg，作鼻背下浸润麻醉，在面中线上中1／3交界处旁开3mm以45度角作切口，塞入带有金葡菌的明胶海绵于内，缝合切口，建立ARS大鼠模型。
1．3 分组和给药：造模后第7天将造模大鼠随机分为金葡菌感染的模型组和鼻渊舒治疗的治疗组，每组10只。其余正常大鼠10只作为正常组。治疗组每日给予鼻渊舒5ml/kg灌胃，模型组每日予生理盐水2ml灌胃，共5d，正常组不灌胃。
1．4 标本的采集与处理：于灌胃结束后处死大鼠，超净台冰盘上摘取鼻粘膜组织，Rnase free液冲洗两次，锡箔包好，置于液氮罐中保存。
1．5 基因芯片检测：参考Schena M等［2］的方法抽提总RNA，用RNeasy mini spin column试剂盒对总RNA进行过柱纯化，分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检，得到纯的mRNA。逆转录标记cDNA探针并纯化，第1次用Cy3标记正常组鼻粘膜组织的mRNA，用Cy5标记模型组鼻粘膜组织的mRNA。第2次用Cy3标记治疗组鼻粘膜组织的mRNA，Cy5标记模型组鼻粘膜组织的mRNA。以大鼠的12个看家基因作为阳性对照，12个人工合成的与大鼠基因没有同源性的70mer Oligo DNA作为阴性对照，以及拟南芥的3个基因作为外标。于42℃杂交过夜后洗涤。ScanArray Express激光扫描仪扫描芯片。
1．6 数据分析：GenePix Pro 4．0图像分析软件对Cy3和Cy5 2种信号的强度和比值进行分析。根据12个看家基因的光比率调整2种荧光的均衡。然后对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化。
1．7 统计学处理：计量资料以�x±s�表示，采用SPSS13．0统计软件包，用�t�值或�t�′值法进行组间差异性检验。
2 结果
2．1 ARS大鼠模型的构建：造模后第7d造模大鼠出现清涕、喷嚏、鼻前庭皮肤水肿或潮红，搔抓鼻部频繁，鼻粘膜的分泌物转为脓性，体温、白细胞(WBC)计数及中性粒细胞(N)百分比等升高，与正常组相比有显著性差异(�P�［3］，而NF-κB具有抗细胞凋亡的作用［4-5］。同时PKC还可通过激活NF-κB促进粘附分子的转录。此外PKC还可通过增加细胞表面整合素与其配体粘附分子的亲和性激活细胞的粘附特性。Kucik DF［6］研究证实PKC表达增加可促进IL-6mRNA合成。Majori［7］发现巨噬细胞PKC激活，可使其TNF-α释放增加。通常情况下，炎细胞坏死时溶酶体破裂，可释放大量炎症介质，引发新一轮炎症反应，而炎症细胞凋亡可避免这种情况的发生。粘附分子大量产生，整合素过度活跃可导致中性粒细胞过度聚集激活，加重组织损伤。IL-6、TNF-α的过度产生释放也可导致炎症反应亢进损伤正常组织。因此本实验推测鼻渊舒可能通过下调PKC基因表达，由NF-κB通路促进炎症细胞凋亡，减少粘附分子、IL-6、TNF-α的合成而起到阻止炎症反应亢进、保护正常组织的作用。
实验证实鼻渊舒可下调Rgc32 protein基因表达。糖皮质激素(GCS)具有强大的抗炎作用［8-9］，糖皮质激素受体(GR)是GCS发挥重要生理病理功能的中介物，GCS与GR结合形成GCS-GR复合物进入细胞核，与糖皮质激素负反应成份(nGRE)相互作用，可强烈的抑制细胞因子介导的炎症反应。同时活化的GR在细胞核内与NF-κB的Rel A亚基直接偶联，可抑制NF-κB的功能［10］。本实验推测鼻渊舒治疗后Rgc32基因表达下调，可能与治疗后细胞因子产生减少相协调，减弱糖皮质激素对NF-κB功能及细胞因子和炎症介质合成的抑制，从而避免细胞因子和炎症介质合成的过度抑制而导致感染扩散。
实验发现鼻渊舒可下调Acox2基因表达。Acox2能催化不饱和脂肪酸(FFA)氧化和脂化而使组织中FFA降低［11］。FFA可引起NO增加，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达上调［12］。NO为可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)激活剂，系L-精氨酸(L-Arg)的胍基氮被NOS氧化的产物。展新华等［13］证实L-Arg可使大鼠呼吸道纤毛运动加快，其机制与L-Arg通过生成NO，激活sGC，继而增加cGMP水平有关。粘膜纤毛清除功能障碍是鼻窦炎发病的关键环节，增加纤毛摆动的幅度及频率可以改善粘膜纤毛清除功能障碍。因此本实验推测鼻渊舒治疗后Acox2基因表达下调，Acox2生成减少，进而导致组织FFA含量升高，iNOS的表达上调，NO生成增加，鼻窦粘膜纤毛运动频率增快，从而改善粘膜纤毛清除功能障碍。前期实验也已证实鼻渊舒治疗组纤毛运动情况恢复较好，Acox2基因表达下调可能是其发生机制之一。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 总之，本研究首次应用基因芯片技术证实：鼻渊舒口服液能在基因表达水平，从多途径、多环节、整体上调控炎症过程，充分证明了中医方剂作用的多靶点性；基因芯片技术对从微观角度揭示中医药治疗疾病的机理有一定的借鉴作用。
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收稿日期 2006-08-06
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