[芒果皮提取物的体外清除自由基作用研究]清除自由基最好的方法

　　 　　摘要：目的：对芒果皮提取物的体外清除自由基作用进行研究，为芒果皮的开发利用提供理论依据。方法：分别以水、95%乙醇和石油醚为溶剂提取芒果皮有效成分，再采用紫外-可见分光光度法研究芒果皮3种溶剂提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除作用。结果：芒果皮的水提取物、95%乙醇提取物和石油醚提取物对上述3种自由基均有很好的清除作用，并且清除率与样品浓度呈现一定的线性关系，浓度越高，清除作用越强；3种提取物对自由基的清除能力为95%乙醇提取物>水提取物>石油醚提取物。结论：芒果皮提取物对自由基有良好清除作用，在药品和保健品方面具有广阔的开发利用前景。
　　关键词：芒果皮；提取物；自由基；芒果
　　中图分类号：R284文献标识码：A
　　文章编号：1007-2349（2012）02-0050-03
　　
　　芒果系漆树科芒果属植物芒果（Mangifera indical L.）的成熟果实，主产于热带、亚热带，是世界第二大热带水果，被誉为“热带水果之王”。在我国，芒果主要分布在云南（东南部）、贵州（南部）和广西（南部）三省，多为家养栽培，为当地的重要经济作物。研究表明，芒果果皮含有大量的黄酮［1］、山酮［1］、多糖［2］以及种类众多的小分子多酚类物质［3］，具有止咳化痰［4］、抗炎［4］、抑菌［5］、抗氧化［6］等作用。目前，芒果除鲜食外，主要被加工成饮料、罐头、果冻等，加工过程中产生的约占鲜果重量5%~10％的芒果皮则被抛弃，不仅浪费资源，而且污染环境。因此，如何利用废弃的芒果皮资源，进行开发利用，变废为宝，具有十分重要的意义。本文对芒果皮的水提取物、乙醇提取物和石油醚提取物的清除自由基活性进行研究，为芒果皮的科学开发利用提供理论依据。
　　1实验材料
　　1.1试剂与仪器AB204-N型电子天平（瑞士Mettler公司）；Shimadzu UV2401PC紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）；HH-4数显恒温水浴锅（天津市恒温水浴锅厂）；LD-500刀片式粉碎机（长沙市岳麓区常宏制药机械设备厂）；PGX-330A-12H光照箱（宁波莱福科技有限公司）。核黄素（VB2）、氯化硝基四氮唑兰（NBT），番红花红（Safranine T），蛋氨酸，2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）购自Sigma-Aldrich公司。乙醇、石油醚、二甲基亚砜（DMSO）为化学纯，购自昆明汕滇精细化学品有限公司；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
　　1.2药材芒果，购自昆明水果市场。
　　2实验方法
　　2.1芒果皮提取物的制备取新鲜成熟芒果，自来水洗净，晾干，用水果刀均匀削取果皮，果皮厚度约1~5 mm。果皮置阳光下晒干，用刀片式粉碎机粉碎至20 mm以下。称取粉碎后的芒果皮3份，50 g/份，分别加入水、95%乙醇和石油醚500 mL，加热回流提取2 h，重复提取3次，提取液趁热过滤，过滤液合并，减压浓缩为浸膏，冷冻干燥，分别得到水提取物（EW）9.5 g，95%乙醇提取物（EEt）7.3 g和石油醚提取物（EP）3.8 g。取上述芒果皮的水提取物、95%乙醇提取物和石油醚提取物适量，以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂，配制不同浓度的待测溶液，备用。
　　2.2DPPH自由基清除能力测定［7］DPPH用70％的乙醇配制成5×10~5 mol/L的溶液。取上述5×10~5 mol/L的DPPH溶液3.0 mL，加入2.1中不同浓度的待测试样溶液1.0 mL，于25 ℃反应15 min，用紫外-可见分光光度计于517 nm处测定吸光度值As；取5×10~5 mol/L的DPPH 3.0 mL，加入DMSO 1.0 mL，同法测定吸光度值A0。用70％乙醇3.0 mL+DMSO 1.0mL作参比溶液。取3次测试平均值，按下式计算清除率：
　　S（%）=［（A0-As）/ A0］× 100
　　2.3超氧阴离子自由基清除能力测定采用光照核黄素方法［8］。用pH 7.4的PSB缓冲液为溶剂，配制1.67×10~5 mol• L-1核黄素，0.01 mol•L-1蛋氨酸，4.6×10~5 mol•L-1氯化硝基四氮唑兰（NBT）。分别取上述3种溶液各2.0 mL，加入1.2.1中不同浓度的待测试样溶液1.0 mL，置光照箱中于4 500 lx下光照30 min，用紫外-可见分光光度计于560 nm处测定吸光度值As；同法，以1.0 mL DMSO代替样品溶液，测定吸光度值A0。用pH 7.4的PSB缓冲溶液6.0 mL +DMSO 1.0 mL作参比溶液。取3次测试平均值，按下式计算清除率：
　　S（%）=［（A0-As）/ A0］× 100
　　2.4羟自由基清除能力测定采用Fenton反应产生羟自由基使番红花红褪色的方法［9］。取pH 7.4的PSB缓冲溶液1.0 mL，40 μg/mL番红花红1.0 mL，0.945 mmol•L-1 EDTA-Fe（Ⅱ）（新鲜配制）1.0 mL，加入2.1中不同浓度的待测试样溶液0.5 mL，3% H2O2溶液1.0 mL（新鲜配制），混合后在37℃水浴中反应30 min，用紫外-可见分光光度计在520 nm处测定吸光度As；同法，以0.5 mL DMSO代替样品溶液，测定吸光度A0；以0.5 mL DMSO代替样品溶液，以1.0 mL蒸馏水代替3 % H2O2溶液，测定吸光度A。用3.5 mL蒸馏水+PSB缓冲溶液1.0 mL作参比溶液。取3次测试平均值，按下式计算清除率：
　　S（%）=［（A0-As）/（A0 � A）］× 100
　　3实验结果与讨论
　　3.1对DPPH自由基的清除作用DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显深紫色，在517 nm处有强吸收。当与抗自由基活性物质作用时，其孤对电子被配对，因而吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。
　　芒果皮的水提取物（EW）、95%乙醇提取物（EEt）和石油醚提取物（EP）对DPPH自由基均有良好的清除作用，浓度越高，清除能力越强。通过回归分析，得EP的DPPH自由基清除率线性方程为y=10.6x+4.954 5，R2=0.954，IC50=4.25 μg/mL；EW线性方程为y=13.707x+5.477 3，R2=0.954 5，IC50=3.25 μg/mL；EEt线性方程为y=15.658x+6.572 7，R2=0.948 5，IC50=2.77 μg/mL。IC50越小，抗自由基活性越强。依据IC50值，3种提取物对DPPH自由基的清除能力大小为EEt>EW>EP。见图1。
　　图1不同浓度下提取物对DPPH自由基的清除率
　　3.2对超氧阴离子自由基的清除作用用光照核黄素的方法产生超氧阴离子自由基，可使氯化硝基四氮唑兰产生蓝色物质，该物质在560 nm处有最大吸收峰。随着反应的进行，蓝色物质的生成就越多，加入芒果皮提取物样品溶液可使超氧阴离子自由基的产生受到抑制，进而蓝色物质的生成也受到抑制。测定该波长下的吸光度值的变化，可反映芒果皮提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。
　　芒果皮的95%乙醇提取物（EEt）和水提取物（EW）对超氧阴离子自由基的清除作用显著强于石油醚提取物（EP）。3种提取物对超氧阴离子的清除作用与样品浓度呈一定的线性关系，EP线性方程为y=0.416 8x+5.164 3，R2=0.943 5，IC50=107.57μg/mL；EW线性方程为y=0.7855x+5.267 9，R2=0.956 4，IC50=56.95 μg/mL；EEt在0~80 μg/mL范围内呈现良好的线性，y=1.099 5x+3.64，R2=0.987 3，IC50=42.16 μg/mL，当样品浓度≥80 μg/mL，清除率随浓度的变化趋缓。见图2。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　图2不同浓度下提取物对超氧阴离子自由基的清除率
　　羟自由基非常活泼，在含氧自由基中其氧化活性最强，但存在时间短，一般难于直接测定。本文采用间接法测定，其原理是利用Fenton反应产生羟自由基：
　　Fe2++H202Fe3++OH-+•OH
　　产生的羟自由基（•OH）与指示剂发生反应，当体系中存在自由基清除剂时，清除剂与羟自由基作用，使羟自由基对指示剂的作用降低，通过检测指示剂的变化情况，即可获得清除剂对羟自由基的清除能力。根据所用指示剂，通常采用的方法有邻二氮菲法和亚甲基蓝（MB）法等。但这些方法多适用于测定单纯的有机物的活性，不适用于组分复杂的提取物的羟自由基活性的测定。本文采用Fenton反应产生羟自由基使番红花红褪色的方法来测定芒果皮提取物清除羟自由基的活性，该方法具有抗干扰能力强，重现性好，稳定可靠的特点。
　　3.3对羟自由基的清除作用石油醚提取物（EP）线性方程y=17.1x+1.689 3，R2=0.966 2，IC50=2.83 mg/mL；水提取物（EW）在0~1.25 mg/mL范围内呈现良好的线性，y=51.669x+4.490 5，R2=0.981 6，IC50=0.88 mg/mL，当样品浓度≥1.25 mg/mL，清除率随浓度的变化趋缓；95%乙醇提取物（EEt）在0~1.00 mg/mL范围内线性方程为y=84.52x+9.08，R2=0.935 5，IC50=0.484 mg/mL，当样品浓度≥1.00 mg/mL，清除率随浓度的变化明显趋缓。对羟自由基的清除能力大小为EEt>EW>EP。见图3。
　　4结论
　　本文研究表明，芒果皮的3种溶剂提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基均有很好的清除作用，并且清除率与样品浓度呈一定的线性关系，浓度越高，清除作用越强；采用不同的提取溶剂，所得到的提取物清除自由基的能力存在显著差异，对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力为乙醇提取物>水提取物>石油醚提取物。因此，提取芒果皮的溶剂以选择乙醇为宜。
　　现代医学研究证明，自由基会引起人体蛋白质变性、酶失活、DNA链断裂、生物膜结构损伤、细胞解体乃至机体病变和死亡，自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、风湿性关节炎、心脑血管疾病等的重要因素。本文研究表明，芒果皮提取物对不同的自由基均有良好的清除作用，其在药品和保健品方面的应用开发具有巨大潜力，前景广阔。本研究结果为芒果皮的深入开发利用提供了科学依据。
　　
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　　（收稿日期；2011-12-01）
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