过氧化物酶增殖体激活受体β对失血性休克大鼠急性肺损伤的保护作用

许昌海 金红旭 姜腾轩 崔岩 滕玥 葛凤 郑艳梅 李楠 柳云恩 高燕

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.008

基金项目：辽宁省自然科学基金（201202243）

作者单位：
110016沈阳，沈阳军区总医院急诊医学部（许昌海、金红旭、姜腾轩、崔岩、滕玥、葛凤、郑艳梅、李楠、高燕）;全军重症（战）创伤中心实验室（柳云恩）

通信作者：金红旭， Email：Hongxuj@126.com

【摘要】目的观察过氧化物酶增殖体激活受体β对失血性休克大鼠急性肺损伤的保护作用及机制。方法复制失血性休克大鼠ALI 模型，随机（随机数字法）将96 只 SD 大鼠分为5组，每组分为 1 h、2 h、4 h、6 h 四个时相点，每个时相点 6 只老鼠。观察记录在1、2、4、6 h取肺组织测定PPARβ受体表达，行病理学检查、肺干湿重比系数作为检测肺损伤程度的指标;检测肺组织超氧化物酶SOD、GSH-Px活性氧化产物8-iso-PGF2α含量来评估机体氧化应激状态。然后，给予PPARβ受体拮抗剂（GSK 0660）进行预处理，观察其对失血性休克所致急性肺损伤过程中后动物各项指标的影响，并初步探讨炎症因子、氧化抗氧化系统及细胞凋亡在其中的作用。结果①失血性休克致伤组大鼠超氧化物酶SOD、GSH-Px活性较假手术组显著升高（P<0.01）。②GW0742激活剂使 ALI 肺组织中超氧化物酶SOD、GSH-Px活性在各时相点较单纯失血性休克致伤组有不同程度降低，以 2h、4h 升高最显著（P<0.01）。③单独使用 GW0742能改善 PaO₂、大鼠肺组织 W/D 比值、肺组织病理积分，抑制肺组织 SOD、GSH-Px活性 （P<0.01）及降低8-iso-PGF2α的含量;使用拮抗剂 GSK0660使上述作用减轻（P<0.01）。结论①失血性休克ALI大鼠模型，肺组织SOD、GSH-Px活性显著升高，提示失血性休克处于急性氧化应激状态。②GW0742能显著上调 ALI 大鼠肺组织SOD、GSH-Px的活性，降低氧化产物8-iso-PGF2α的含量。③推测GW0742通过可能通过抑制 TNF-α 基因和蛋白的表达，降低肺组织 SOD 活性对 ALI 肺组织起到一定程度的保护作用，减轻 ALI 肺组织的炎症，改善 PaO₂，可能是通过阻止 NF-κB 的活化起作用的。

【关键词】急性肺损伤;过氧化物酶增殖体激活受体;氧化应激;失血性休克;急性呼吸窘迫综合征;炎症反应;细胞凋亡;病死率

Protective effects of peroxisome proliferation activated receptor-β on hemorrhagic shock-induced acute lung injury in rats

Xu Changhai， Jin Hongxu， Jiang Tenxuan，Cui Yan， Teng Yue Ge Feng， Zheng Yanmei， Li Nan， Liu Yunen， Gao Yan. Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command， Laboratory of Rescue Center of  Severe Wound and Trauma PLA ，Shenyang 110016， China

Corresponding author：Jin Hongxu，  Email：Hongxuj@126.com

【Abstract】ObjectiveTo observe the protective effects of peroxisome proliferation activated receptor-β （PPAR-b） on acute lung injury in the wake of hemorrhagic shock in rats in order to illuminate the mechanism.Methods After ALI model of rat was established following hemorrhagic shock， 96 SD rats were divided randomly（random number） into 4 groups：
group A （sham operation group）， group B （ALI group）， group C （GSK0660， an antagonist to PPAR-b given prior to exsanguinations for pretreatment） and group D （GW0742， an agonist of PPAR-b given before exsanguinations for pretreatment）. Each group was further divided into 1 h， 2 h， 4 h and 6 h subgroups. Six mice of each subgroup were sacrificed at each interval. Expression of PPAR-β receptor in lung tissues was detected at 1 h， 2 h， 4 h and 6 hours. Pathological examination and lung wet/dry weight ratio were detected， and lung tissue antioxidant enzyme SOD and 8-iso-PGF2α， the oxidation product of activated GSH-Px were evaluated. Results①Antioxidant enzymes SOD and activated GSH-Px were significantly higher in ALI group than those in the sham operation group （P<0.01）. ②The antioxidant enzyme SOD and activated GSH-Px in lung tissue in GW0742 group decreased at each interval especially at 2 h and 4 h compared with ALI group （P<0.01）. ③ GW0742 used alone can improve PaO₂， W/D ratio of lung tissue of rats， lung pathology integral， and inhibit the activity of SOD and GSH-Px in lung tissue （P<0.01） and decrease the content of 8-iso-PGF-2α. The antagonist GSK0660 can lessen the above effects （P<0.01）. Conclusions ①ALI emerged from hemorrhagic shock in rats leading to significantly increased activity of SOD and GSH-Px in lung tissue， suggesting rats subjected to acute oxidative stress. ②GW0742 can up-regulate the levels of SOD and GSH-Px in lung tissue of rats with ALI. It also decreased the content of 8-iso-PGF2 α， the oxidation products of GSH-Px. ③  It was suggested that GW0742 might inhibit the expression of TNF-α  mRNA and level of TNF-a protein， and decreased SOD activity in lung tissue， protecting lung tissue to some degree from ALI and improving PaO2. The mechanism of it may be attributed to preventing NF-κ B activation.

【Key words】Acute lung injury; Peroxisome proliferator-activated receptor; Oxidative stress;Hemorrhagic shock; Acute respiratory distress syndrome; Inflammatory response;Apoptosis; Mortality

失血性休克是常见的临床急症，肺脏由于其结构特点，在失血性休克后极易受累，引起急性肺损伤（ALI）^[1]，若得不到及时有效地治疗，可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。过氧化物酶增殖体激活受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）是一种细胞核内新的甾体激素受体，在体内可分为3型，即α、β和γ。PPARα及PPARγ由其激活剂活化后可调控多种核内靶基因的表达，影响人体糖脂代谢、细胞发育等过程^[2]。PPARβ可能与许多炎性疾病密切相关^[3]。另有研究发现PPARβ具有广泛的抗炎效应^[4]，其活化可以减轻脓毒症小鼠肺组织炎症反应，改善多个重要脏器的功能^[5]。但是也有研究表明在脓毒症所致的急性肺损伤发生过程中，PPARβ在肺组织中表达上调，受体激活后仍有大量的炎症因子释放，而其机制仍未明确^[6]。为此，本研究观察ALI过程中肺组织F超氧化物酶SOD和氧化产物8-iso-PGF2α含量来评估机体氧化应激状态;在复制失血性休克大鼠ALI 模型的基础上分别给予 PPAR-β的特异性激活剂、拮抗剂进行干预，探讨 PPAR-β对失血性休克大鼠肺组织是否具有保护作用。

1材料与方法

1.1动物模型和分组

1.1.1模型制作健康清洁级2～4月龄雄性SD大鼠96只（由沈阳军区总医院动物实验中心提供），体质量280～320 g。复制模型前，各处理组大鼠分别给予静脉注射激动剂和拮抗剂，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后，分离双侧股动脉和单侧股静脉，0号线将动脉远心端结扎，并向近心端方向置入PE-50管。大鼠全身肝素化（800 IU/kg i.v.）后，将多道智能生理信号记录系统探头连接于一侧股动脉，记录平均动脉压波形变化。10 min后缓慢持续地由一侧股动脉放血并维持平均动脉压至（40±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），这一过程在10 min以上，并至少维持2 h。分别在 1、2、4、6 h 时相点活杀大鼠并采样。

1.1.2主要试剂GW0742（激动剂）、GSK0660（拮抗剂）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒 、大鼠 8-iso-PGF2αELISA 检测试剂盒（以上试剂均由上海优宁维生物科技有限公司提供）。

1.1.3实验分组 随机（随机数字法）分组 A组为假手术组;B组为失血性休克致急性肺损伤模型组;C组GSK0660组;D组GW0742组，每组分1、2、4、6 h四个时相点，每个时相点6只大鼠。

1.1.4标本采集大鼠作颈部正中切口，分离右侧颈动脉并插管备用。在预定时相点迅速采集颈动脉血0.6 mL做动脉血气分析;大鼠放血活杀、剖胸暴露肺脏，观察其外观，剪取右肺下叶，取10%甲醛溶液固定，24 h内送病理检查。每只大鼠取肺组织0.4 g，加入9倍生理盐水用电动匀浆器制成10%匀浆液，离心（4 ℃，1800 r/min，6 min）留取上清，-20 ℃保存备用。各取左肺下叶肺组织经锡纸包装标记后，迅速置液氮中保存备用。余肺叶作湿/干比值（W/D）测定。

1.1.5观察指标观察各组大鼠的分钟呼吸频率、心率、平均动脉压、刺激反应等一般情况。用IL-1620型血气分析仪测定动脉血氧分压（PaO₂）等指标。

W/D比值测定：肺组织称得湿重后，置80 ℃电热真空干燥箱内烘干 48 h 至恒重，称取干重，计算 W/D 比值。

肺组织超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：按试剂盒要求配制好1～7号试剂;将冻存于液氮中的肺组织块取出，取部分电子天平称量，以配制好的2号试剂为匀浆介质，按质量体积比为 1∶19 加匀浆介质制备成 5%的组织匀浆;取5%组织匀浆0.9 mL加3号试剂0.1 mL，充分混匀后37 ℃水浴15 min，待测。每个样本设测定管和对照管，测定管加入待测样本0.2 mL、4号试剂0.2 mL、显色剂3 mL;对照管则加入待测样本0.2 mL、4号试剂0.2 mL、蒸馏水3 mL，混匀，37 ℃水浴30 min 后各加入7号试剂0.05 mL，再次混匀，60 ℃水浴10 min，取出后立即用分光光度计在460 nm处，蒸馏水调零，测量各管的吸光度。以每克组织湿片在37 ℃的反应体系中H₂O₂被分解1 μmol为1个酶活力单位，根据以下公式计算肺组织SOD活性：SOD活力单位/g湿片。

1.1.6 病理形态学检查肺脏色泽、体积、病灶和切面等脏器大体病理改变;10%甲醛溶液固定右肺下叶，石蜡包埋、切片（5 μm），H.E 染色，光学显微镜观察。依据肺间质水肿、肺泡水肿、炎性细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成和肺不张改变的程度（无、轻度、中度、重度）分别记 0、1、2、3分，然后累计总分。

1.1.7肺组织8-iso-PGF2α的表达的测 定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠8异前列腺素F2α（8-iso-PGF2a）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠8异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样品含量。

1.2统计学方法

应用 SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，进行多组均数方差齐性检验及成组设计的方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1对大鼠PaO₂的影响

如表1所示，D组（激动剂组）各时相点的 PaO₂均较B组各相应时相点有升高（P<0.01）。C组（拮抗剂组）各时相点的 PaO₂均较B 组相应时相点显著降低（P<0.01）。在1 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在2 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在4 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在6 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）。

2.2对大鼠W/D比值的影响

D组各时相点的W/D比值均较B组相应时相点显著降低（P<0.01）。C 组各时相点的W/D比值均较 B 组相应时相点显著升高（P<0.01）。见表2。在1 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在2 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在4 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在6 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）。

2.3对大鼠肺组织 SOD 活性的影响

D 组 1 h、2 h 时相点的 SOD 活性较 B 组相应时相点升高（P<0.01）。C组各时相点的SOD活性均较B组相应时相点降低（P<0.01），以2 h、4 h升高最为显著（P<0.01）。见表3。在1 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在2 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在4 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在6 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）

2.4对大鼠肺组织病理改变的影响

大体观察，D组各时相点肺组织的损伤程度较B组有减轻，以2 h较明显;C组肺组织的损伤程度较B组加重。光镜观察：肺组织石蜡切片，H.E 染色显示，各干预组在各时相点肺组织有不同程度的水肿，肺间质增宽，炎性细胞浸润，渗出，出现肺泡结构破坏等病理改变。病理形态学积分显示，D 组 1、2、4、6 h 病理学积分较 B 组相应时相点降低（P<0.01）;但高于假手术组（P<0.01）。C 组各时相点病理学积分均较 B 组相应时相点明显升高（P<0.01）。见表4。在1 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在2 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在4h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在6 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）。

2.5对大鼠肺组织 8-iso-PGF2α表达的影响

D组各时相点的8-iso-PGF2α表达量较B组相应时相点降低（P<0.01）。C 组各时相点的8-iso-PGF2α表达量均较B组相应时相点升高（P<0.01），以2 h、4 h升高最为显著（P<0.01）。见表5。在1 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在2 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在4 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）;在6 h时间点B、C、D组分别与A组比较差异具有统计学意义 （P<0.01）。

3讨 论

失血性休克常导致外周组织缺氧和全身脏器缺血，诱发中性粒细胞的活化和促炎因子的产生，继发ALI，如得不到及时控制就会发展成ARDS，增加了患者的发病率和病死率^[7]。本实验参照Benhamou等^[8]研究建立大鼠失血性休克模型，与A组比较，失血性休克后肺组织发生了明显的病理改变，提示失血性休克后有肺损伤的发生。

机体在正常代谢中，不可避免地产生许多自由基，对机体起破坏作用。同时体内存在自由基防御系统，如超氧化物歧化酶（SOD），保护机体免受损伤。SOD活力的高低直接影响机体的抗氧化能力，在失血性休克机体应激反应中起着重要的作用。8-iso-PGF2α是经自由基催化不饱和脂肪酸发生脂质过氧化后的终末产物，其产生机制以及产生过程与氧化损伤密切相关，由Morrow等^[9]在1990年首次用气相色谱-质谱测定方法发现，是脂质过氧化作用后的特异性产物。8-iso-PGF2α属于异构前列腺素家族成员，由于其含量稳定，生成过程亦不受药物及其他因素影响，能灵敏的反应体内氧化应激的强度，被认为是目前衡量机体脂质过氧化损伤程度以及机体氧化应激最理想的生化指标^[10-13]。在肺脏，肿瘤坏死因子α（TNF-α）主要由肺泡巨噬细胞产生。TNF能够激活JNK激酶和核因子（NF-κB），可诱导化学趋化素和黏附分子的表达^[14]。有研究表明，大剂量TNF可导致肺组织中性粒细胞浸润和肺损伤^[15]。核因子NF-κB于1986年在B淋巴細胞中首先被发现^[16]，后发现其存在分布广泛，在细胞生长、炎症、凋亡有关的许多基因表达中起着重要作用^[17]。目前有研究认为，NF-κB对细胞内炎症与免疫反应的基因表达起着关键性的调控作用^[18]。有研究表明，NF-κB 是炎症反应信号转导通路的中枢之一^[19]，而TNF-α与ALI 的发病关系密切，其水平高低可直接反映病情的严重程度。大鼠失血性休克导致的ALI，主要是通过核因子（NF-κB）及转录因子（AP-1）的活化，增强 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8等的基因转录，使上述物质产生和释放增多，进而再次激活 NF-κB。本研究发现致伤后SOD活性明显降低。表明ALI过程中存在致炎物质的释放过度增强，因此笔者推测在这个强烈的炎症过程中，可能存在相应的抗炎活性减弱及抗炎物质合成或者释放减少，导致抗炎与致炎的失平衡。最近发现GW0742激活PPAR-β的活性后，可调控炎症因子的表达，参与炎症反应^[20]，并能从转录水平抑制多种炎性介质的基因表达。GW0742可能通过激活PPAR-β后，可能在一定程度上阻止了NF-κB的进一步活化，增强了SOD的活性，在临床上表现为大鼠缺氧及呼吸窘迫症状较致伤组大鼠明显改善^[21]。

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（收稿日期：2014-07-26）

（本文编辑：何小军）

p1333-1337