银杏二萜内酯类化合物拮抗PAF诱导的血小板聚集及对神经细胞的保护作用

徐君+王奎龙+曹泽彧+曹亮+王振中+萧伟

[摘要] 该研究通过对银杏二萜内酯类化合物拮抗PAF诱导的血小板凝集和神经保护作用进行检测来探讨银杏内酯制剂治疗缺血性脑卒中的作用机制。实验以PAF作为血小板聚集诱导剂，将银杏二萜内酯分别加入采集的兔血中，采用比浊法检测各化合物对血小板凝集的抑制作用；
在L-谷氨酸诱导的原代皮质神经细胞损伤模型上采用MTT检测细胞活率，使用荧光染料Fura-2 AM检测细胞内游离钙离子浓度，通过Hoechst 33258染色法检测银杏二萜内酯对神经细胞凋亡的抑制作用。结果发现银杏二萜内酯类化合物中抑制PAF诱导的血小板凝集活性大小依次为银杏二萜内酯K（GK）、银杏二萜内酯B（GB）、银杏二萜内酯A（GA）、银杏二萜内酯C（GC）、银杏二萜内酯M（GM）、银杏二萜内酯J（GJ）和银杏二萜内酯L（GL）；
其中GB和GK（1～100 μmol·L-1）能显著减轻L-谷氨酸所致的细胞损伤，表现为神经细胞活率明显提高（P<0.05），细胞内钙离子浓度明显下降（P<0.05）和细胞凋亡率明显减少（P<0.05）。该研究明确了银杏二萜内酯各化合物在抑制PAF诱导的血小板凝集和神经细胞保护方面的活性与作用特征。

[关键词] 银杏二萜内酯类化合物；

拮抗PAF受体；

神经保护；

凋亡；

Ca2+超载

[Abstract] To study the antagonistic effect of ginkgolide homologues on platelet-activating factor （PAF）-induced platelet aggregation and investigate its neuroprotective effect. PAF was used as a coagulant， and ginkgolides were added to the rabbit blood samples respectively. The inhibitory effect of each compound on platelet aggregation was detected by turbidimetry. In L-glutamate induced primary cortical neuron cell injury model， MTT assay was used to detect cell viability. Intracellular free Ca2+ concentration in neurons was measured by using the fluorescent Ca2+ indicator Fura-2 AM. Morphological observation and Hoechst 33258 staining were used to detect the inhibitory effect of ginkgolide on neuronal apoptosis. The results showed that the inhibitory effect on PAF-induced platelet aggregation activity in ginkgolide homologues was ginkgolide K （GK）， ginkgolide B （GB）， ginkgolide A （GA）， ginkgolide C （GC）， ginkgolide M （GM）， ginkgolide J （GJ） and ginkgolide （GL） from high to low. GB and GK （1-100 μmol·L-1） could significantly reduce the cell damage caused by L-glutamate， with survival rate increasing， intracellular calcium concentration reducing and cell morphology restoring. This paper has identified the activities and characteristics of various compounds of ginkgolide homologues on PAF-induced platelet aggregation as well as its neuroprotective effect.

[Key words] ginkgolide homologues；

antagonistic to PAF receptor；

neuroprotection；

apoptosis；

Ca2+ overload

缺血性脑卒中是指脑部供血动脉狭窄或堵塞引发的脑组织局部供血、供氧、供糖等不足，进而导致脑组织坏死的一类疾病的总称。缺血性脑卒中发生后，脑损伤组织内血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）水平上升和神經突触过度分泌兴奋性氨基酸如谷氨酸是导致病情继续恶化的主要原因。高浓度PAF会引发炎症和氧化应激[1]，而过量的兴奋递质会引起神经细胞凋亡和坏死[2]。目前缺血性脑卒中的主要治疗方法有血压、血糖、血氧控制相关的基础治疗，溶栓治疗，抗凝血抗血小板治疗和神经细胞保护治疗[3]。其中抗凝血抗血小板药物和神经保护药物是治疗缺血性脑卒中药物开发的热点。

银杏萜内酯化合物是从银杏叶中提取的结构相似有一定药理活性的一类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成[4]，其中倍半萜内酯白果内酯被证明没有明显的抑制凝血功能，但有神经保护作用[5-6]，而二萜内酯类成分具有广泛的药理活性[7]。目前已经在银杏叶中成功分离出到多种银杏二萜内酯，它们分别是银杏二萜内酯A（ginkgolide A，GA）、银杏二萜内酯B（ginkgolide B，GB）、银杏二萜内酯C（ginkgolide C，GC）、银杏二萜内酯J（ginkgolide J，GJ）、银杏二萜内酯K（ginkgolide K，GK）、银杏二萜内酯L（ginkgolide L，GL）、银杏二萜内酯M（ginkgolide M，GM）等，结构见图1。endprint

GB是目前发现的最强的天然PAF受体拮抗剂之一，对心肌细胞和神经细胞具有显著的保护作用，具有开发成抗血栓和治疗心脑血管疾病的潜力[8]，但对于GB以外的二萜内酯化合物药理活性报道较少，本文对银杏二萜内酯类化合物拮抗PAF诱导的血小板凝集和神经保护作用进行研究和比较。

1 材料

LG-PABER-I 血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司）；
80-2台式低速离心机[上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂]；
Sartorius分析天平（北京多利斯天平有限公司）；
CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific公司），酶标仪（Bio-Rad公司）；
RF-5000型荧光分光光度计（日本岛津）。

枸橼酸钠、二甲基亚砜（DMSO），EGTA，Triton X-100，多聚甲醛购于南京化学试剂公司；
盐酸利多卡因购于上海朝晖药业；
PAF：Sigma公司，用生理鹽水配成10 mg·L-1；

L-谷氨酸购于Sigma公司，用DMEM溶解至1.6 mmol·L-1并用NaOH 溶液调节pH 至7.0过滤除菌；
GA，GB，GC，GJ和GK购于上海源叶生物公司；
GL和GM由江苏康缘药业股份有限公司自行分离纯化制备，用DMSO溶解；
高糖DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibco公司；
磷酸缓冲液（PBS）购于凯基生物公司；
阿糖胞苷购于上海源叶生物公司；
MTT（噻唑蓝）、荧光染料Fura-2 AM购于Solarbiol公司；
Hoechst 33258购于Sigma公司；
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（13721800）购于Roche公司。

雄性家兔20只，体质量2.0～3.0 kg，购于南京市青龙山动物养殖场，许可证号SCXK（苏）2012-008；
SD乳鼠购于南京市青龙山动物养殖场，许可证号SCXK（苏）2017-0001。

2 方法

2.1 富血小板血浆采集 取家兔2只，用利多卡因腹腔注射麻醉，手术分离颈总动脉取血，用3.8%枸橼酸钠溶液以1∶9抗凝，800 r·min-1离心10 min，取上清作为富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再以3 000 r·min-1离心10 min，取上清作为贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）[9]。

2.2 富血小板血浆处理 用PPP调节PRP的血小板浓度至360×109～400×109 个/L，通过比浊法进行血小板聚集实验。在检测管中加入260 μL PRP和不同浓度的受试药物30 μL（1.5 μL DMSO和27.5 μL生理盐水），室温孵育5 min，加入10 μL PAF（终质量浓度为7 mg·L-1）作为诱导剂，观察记录5 min内最大聚集率[10-11]。用等量生理盐水作为空白对照，同时用等量生理盐水（含1.5 μL DMSO）作溶剂对照，计算各受试化合物不同浓度下的抑制率，并通过作抑制率-浓度标准曲线计算IC50。

抑制率=（对照组5 min内最大聚集率-待测样品组5 min内最大聚集率）/（对照组5 min内最大聚集率）×100% （1）

2.3 原代小鼠脑皮质神经细胞分离[12]及培养 将新生SD乳鼠（24 h内）于-20 ℃冰箱冷冻10 min。75%乙醇消毒后断头取脑，在解剖液中仔细剥离脑膜，分离出皮层组织并用眼科剪剪成300～500 μm的脑片，转移到装有解剖液的小皿内，加入2.5%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min。消化结束后将组织块取出，用含10%血清的DMEM培养基终止消化，吹打均匀后过200目筛，细胞计数后用10%血清的DMEM培养基调整细胞浓度至1.0×109个/L。将神经细胞接种到用10 mg·L-1多聚赖氨酸溶液处理过的培养板中，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

接种24 h待细胞贴壁后换液，继续培养48 h 后，加入阿糖胞苷使其终浓度为50 μmol·L-1以抑制非神经细胞生长，作用72 h后更换含10%血清的DMEM培养基继续培养，经南京医科大学病理研究室对原代细胞鉴定为原代皮质神经细胞，第8天用于神经细胞损伤模型实验。

2.4 L-谷氨酸致原代皮层神经细胞损伤模型的建立及药物处理 取培养至第8天的神经细胞弃去培养基，用PBS清洗2次后，在无血清DMEM培养基分别加入终浓度为1，10，100 μmol·L-1的银杏二萜内酯化合物和终浓度为0.8 mmol·L-1的L-谷氨酸共同处理30 min后，换成无血清DMEM继续培养24 h[13]。

2.5 MTT 法检测细胞存活率 取原代大脑皮层神经以1×109个/L密度接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100 μL，按上述条件培养8 d并按上述药物处理方法处理细胞24 h后，每孔用PBS清洗2次，每孔加入100 μL含MTT浓度为0.5 g·L-1的DMEM培养基，37 ℃避光孵育4 h，弃去培养基，每孔加入200 μL DMSO，振荡数5 min后采用酶标仪于570 nm处测吸光度。

细胞活率=（检测组吸光度-空白培养基吸光度）/（空白组吸光度-空白培养基吸光度）×100% （2）

2.6 乳酸脱氢酶（LDH）漏出率的检测 LDH是一种稳定的蛋白酶，存在于正常细胞的胞质中，正常情况下不能透过细胞膜，当细胞受到损伤时，细胞膜通透性增加，LDH即被释放到细胞外。乳酸脱氢酶活性测定：按上述条件培养8 d并按上述药物处理方法处理细胞24 h后，收集培养基上清100 μL，将剩余细胞加入裂解液处理，按照试剂盒说明书分别测定上清液LDH活性和细胞裂解液的LDH活性，根据公式计算每组LDH漏出率[14]。

LDH漏出率= 培养基上清液LDH活力单位 /（细胞裂解液LDH活力单位+培养基上清液LDH活力单位）×100% （3）endprint

2.7 Fura-2 AM双波长荧光法测定细胞内钙离子浓度[15] 神经细胞经药物处理24 h后，用胰蛋白酶消化并收集细胞悬液，加入Fura-2 AM（终浓度为5 μmol·L-1）于37 ℃恒温培养箱中振荡30 min，2 000 r·min-1离心5 min，用Hanks 清洗2次后混悬。采用荧光分光光度计（RF-5000型，日本岛津）进行荧光测定，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380，340 nm，发射波长为500 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。

其中，R是实验中观察到的荧光比值（F340/F380）；
37 ℃时Kd为224 nmol·L-1；
Rmax为神经细胞加入0.09% Triton X-100透化后测得的F340/F380，Fs为神经细胞加入0.09% Triton X-100透化后在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度（F380），Rmin为神经细胞加入Triton X-100 透化后再加入EGTA（终浓度为3 mmol·L-1）的F340/F380，F0为神经细胞加入Triton X-100透化后再加入EGTA后在380 nm激发光下测得的荧光强度（F380）。

2.8 Hoechst 33258 荧光染色 荧光染料Hoechst能与DNA双链中的小沟结合，能够对细胞核进行标记，当细胞发生凋亡时，染色质会发生固缩，细胞核呈致密浓染，经过Hoechst染色后，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞呈现出亮蓝色[16]。取药物处理细胞和正常培养细胞，吸去培养基后，用4 ℃预冷的PBS 洗3 次，加入4 ℃预冷的体积比为4%的多聚甲醛溶液（用PBS溶解）于室温固定30 min，然后用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，加入Hoechst 33258至终浓度为2.5 mg·L-1，并于室温避光染色5 min。染色结束用PBS 清洗3 次，荧光显微镜下观察细胞核形态并拍照，同时对视野内的正常细胞和凋亡细胞进行计数并计算细胞凋亡率[17]。

2.9 数据处理 实验数据以±s表示；
组间比较采用One way-ANOVA检验。

3 结果

3.1 银杏二萜内酯类化合物对PAF诱导的血小板凝集的影响 在体外实验中发现生理盐水组和溶剂对照组最大聚集率分别为（65.24±4.21）%，（63.58±3.53）%，各银杏二萜内酯化合物对PAF诱导家兔血小板聚集均有一定作用，并且呈量效关系，IC50见表1，其中GB和GK活性最强，其IC50分别为0.57，0.31 μmol·L-1，GJ，GL和GM活性较弱，IC50分别为31.5，45.5，21.0 μmol·L-1。

3.2 银杏二萜内酯类化合物对谷氨酸诱导的神经细胞活性的影响 原代乳鼠脑皮质神经细胞经过分离培养后，对谷氨酸的造模剂量进行研究后，发现剂量在0.8 mmol·L-1诱导细胞发生凋亡最为合适。原代神经经L-谷氨酸（0.8 mmol·L-1）处理后，细胞活率明显低于对照组，约为空白组55%。不同浓度的银杏二萜内酯和谷氨酸共同处理细胞30 min， 换液继续培养24 h后检测发现GA，GB和GK对细胞的保护最为明显，在100 μmol·L-1的濃度下，细胞活率达到了空白组的75.3%，89.2%，91.3%，见表2。

3.3 银杏二萜内酯类化合物对谷氨酸诱导神经细胞乳酸脱氢酶（LDH）漏出的影响 LDH主要分布于活细胞的胞浆内，正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到损伤后，LDH被释放到细胞外，因此可以利用LDH释放率来判断细胞的损伤程度，见图2。经L-谷氨酸处理的模型组细胞LDH漏出率明显升高，银杏二萜内酯同系物对L-谷氨酸诱导的乳酸脱氢酶泄漏都有一定的影响，其中GA，GB，GK对细胞的保护最为明显，表明这3种化合物对L-谷氨酸诱导的细胞损伤具有一定的保护作用。

3.4 银杏二萜内酯类化合物对L-谷氨酸诱导神经细胞凋亡时细胞内[Ca2+]i的影响 在缺血性损伤中，神经细胞内Ca2+浓度升高并引发病理反应是导致神经细胞死亡的原因之一，有研究发现GB在神经细胞兴奋毒性情况下能抑制Ca2+内流，从而保护神经[13]，见表3。本实验通过Fura-2 AM 双波长荧光法对神经细胞胞内的Ca2+进行检测，结果发现空白组神经细胞胞内离子浓度较低，L-谷氨酸处理后，胞内离子浓度约为空白组的2倍，化合物GA，GB，GC，GK（1～100 μmol·L-1）处理后，神经细胞内Ca2+浓度都有剂量依赖性的降低，其中GB和GK抑制效果显著。

3.5 银杏二萜内酯类化合物对谷氨酸诱导神经细胞凋亡的影响 采用Hoechst 33258 染色后可见正常神经细胞胞核颜色均匀分散呈深蓝色，用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸处理后，模型组细胞核大小不一，部分细胞核发生皱缩，同时伴有染色质凝聚及核碎片出现，颜色为亮蓝色。GA，GB，GC，GJ，GK，GL（10 μmol·L-1）处理细胞后与模型组相比，视野内细胞凋亡率都有一定程度的降低，见表4，其中GA，GB，GK抗凋亡效果明显，视野内亮蓝色凋亡细胞显著减少，正常细胞数目较多，见图3。

4 讨论

PAF是在1972年由Bemrniste等[18]发现的一种具有生物活性的脂质分子，研究发现PAF在体内 具有类似于激素的生物活性，能作用于多种组织和细胞，除了能够促进血小板活化和血栓形成，还有研究表明过量的PAF可以导致神经炎症和血管通透性增加。

研究发现GB是一类天然的PAF受体拮抗剂，GB治疗脑缺血的机制主要有包括抗血小板聚集，抑制神经细胞凋亡，抗炎症，抗氧化等[19]。本实验通过对银杏二萜内酯类化合物拮抗PAF受体的活性进行研究，其中体外血小板聚集实验结果表明，抑制血小板聚集（PAF）能力大小依次为GK，GB，GA，GC，GM，GJ，GL，实验表明银杏二萜内酯类化合物对PAF受体具有拮抗作用，不仅可以抑制血栓形成，还可以抑制PAF过度释放导致的神经炎症、细胞凋亡、氧化损伤、血管通透性增加。同时也发现虽然各二萜类内酯化合物都具有相似的结构，但活性强弱明显不同，可能与它们与受体结合能力的强弱有关。endprint

谷氨酸是由神经细胞突触分泌一种兴奋性神经递质，但在脑卒中、脑外伤等情况下，脑神经细胞外液谷氨酸浓度过高，强烈刺激谷氨酸受体引起神经细胞损伤和死亡。本实验中用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸处理原代皮质神经元后发现细胞损伤明显，细胞活力显著降低，乳酸脱氢酶泄漏明显，细胞内钙离子浓度升高。而银杏二萜内酯类化合物均具有不同程度的保护作用，其中GB和GK对神经细胞的保护作用明显，尤以GK为佳，Hoechst 33258染色检测结果显示L-谷氨酸主要机制是诱导凋亡，而GB，GK能显著抑制谷氨酸导致的凋亡。

本文通过对银杏二萜内酯类化合物体外血小板聚集抑制和神经保护作用的研究，明确各化合物作用效果。该结果表明，银杏二萜内酯是银杏类制剂治疗脑卒中的有效成分，其中以GA，GB，GK活性较强，能够从抑制血小板聚集和神经保护两方面来治疗脑卒中。

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[责任编辑 孔晶晶]endprint