山东省葡萄主要病毒病的分布及病原鉴定

吴斌 徐德坤 姜珊珊 张眉 王升吉 马永利 辛志梅

摘要：葡萄病毒病严重影响葡萄的产量和品质，是制约葡萄产业发展的重要因素。为明确该病害在山东省的最新分布状况及病原种类，2016—2018年采用田间调查结合RT-PCR检测等方法对山东省葡萄主要病毒病进行了研究。结果表明，186份样品中共检出GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5种病毒，检出率分别为18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%，且复合侵染发生普遍，检出率为16.67%;树龄较大的葡萄园以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染为主，新建葡萄园以GRSPaV、GFkV病毒侵染为主。研究结果可为山东省葡萄病毒病的早期预防提供理论指导。

关键词：山东省;葡萄病毒病;RT-PCR检测;病原鉴定

中图分类号：S432.4+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）12-0073-05

Abstract Virus diseases are important threats to the yield and quality of grape， restricting the development of grape industry. In the study， the methods such as RT-PCR and field investigation from 2016 to 2018 were used to investigate the distribution and pathogen species of virus disease in Shandong Province. The results showed that five viruses including GLRaV-1，GLRaV-3，GRSPaV，GFLV and GFkV were detected from 186 samples and the corresponding detection rates were 18.82%，9.68%，16.67%，1.61%，33.87%， respectively.The compound infection commonly occurred with the detection rate of 16.67%. In the vineyards with large tree-age grape，GLRaV-1 and GLRaV-3 were the main viruses;and in the newly-built vineyards，GRSPaV and GFkV were the main pathogen species. The results provided a theoretic guide for the early prevention against grape virus disease in Shandong Province.

Keywords Shandong Province; Grape virus disease; RT-PCR detection; Pathogen identification

葡萄（Vitis vinifera L.）作为一类重要的经济作物，在我国果树生产中具有举足轻重的地位，种植面积和产量均居世界第二位[1]，同时也是感染病毒病最多的果树之一，该类病害的发生严重影响葡萄的产量和品质，是制约葡萄产业发展的重要因素[2]。目前，国内外已报道的葡萄病毒病病原种类达66种[3]，中国至今仅报道其中13种，包括葡萄卷叶相关病毒1～5、7（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV-1～5，7）、沙地葡萄茎痘相关病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）、葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus，GFkV）、葡萄A病毒（grapevine virus A，GVA）、葡萄B病毒（grapevine virus B，GVB）、葡萄E病毒（grapevine virus E，GVE）和灰比诺葡萄病毒（grapevine pinot gris virus，GPGV）等[4-6]。其中，分布较广、危害较重的有GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GFkV、GFLV和GPGV，而病毒的复合侵染会加重对葡萄的危害[7]。

山东省是葡萄种植大省，常年种植面积在4.32×104  hm2左右，居全国第三位。近年来葡萄产业迅猛发展，栽培面积不断扩大，苗木引种日益频繁，但由于缺乏完善的病毒病检测规范，山东省各地葡萄病毒病发生普遍，尤其是新建果园，严重地块病株率高达60%以上，严重影响了经济效益。对于山东省葡萄病毒病的系统研究较少，潘志勇等[8]发现GFLV和GLRaV是山东省葡萄产区主要病毒病，尚佑芬[9]、王升吉[10]等对山东省GRSPaV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3病毒进行了检测，周莹等[11]对胶东半岛地区葡萄病毒病进行了普查，发现主要病原为GFkV、GLRaV-1和GLRaV-3。本研究于2016—2018年采集山东省葡萄主产区病毒病疑似样品，基于田间调查与分子生物学检测方法，明确了山东省葡萄病毒病的最新分布、主要的病原种类及复合侵染类型，为山东省葡萄病毒病的早期预防奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2016—2018年于山东省烟台市、青岛市、日照市、潍坊市、临沂市、聊城市和德州市7个葡萄主产区采集具有花叶、褪绿、黄化、畸形、皱缩等疑似病毒病症状的葡萄叶片样品共186份，将采集的样品保存于-80℃冰箱，以未感病的健康葡萄叶片作为阴性对照。

主要试剂：TransZol Plant多糖植物总RNA提取试剂盒、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株（北京全式金生物技术有限公司）;2 × Es Taq Master Mix（Dye）（北京康为世纪生物科技有限公司）;HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京诺唯赞生物科技有限公司）;Plus DNA Extraction Kit（GeneMark公司）;DNA Marker、pMD18-T克隆载体、Solution Ⅰ（TaKaRa公司）;特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

主要仪器：AE224C自动内标电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）;MM400组织研磨仪（德国Retsch公司）;Mastercycler nexus PCR仪、Centrifuge 5430R离心机（德国Eppendorf公司）;JY300电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）;GelDoc-It 310 Imaging System凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.2 总RNA的提取及cDNA合成

称取0.1 g葡萄叶片样品，置于2 mL离心管中，加入灭菌钢珠，液氮冷冻后迅速在组织研磨机上研磨至粉末状，并按试剂盒说明书提取叶片总RNA，-80℃保存。

以提取的植物总RNA为模板，在0.2 mL的RNase-free离心管中依次加入模板RNA 6 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 2 μL，65℃变性10 min后立即冰上放置2 min，再加入2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，25℃ 5 min;50℃ 45 min;85℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20℃备用。

1.3 PCR扩增

根据已报道的13种葡萄病毒病相关病毒序列设计特异性引物（表1），以cDNA为模板分别进行PCR扩增，扩增体系如下：cDNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O补足总体积至30 μL。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4 PCR产物回收、测序及分析

参照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段，并与pMD18-T载体连接，转化DH5α菌株，挑取阳性克隆，经菌落PCR验证后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序结果与GenBank中的序列进行Blast比对，分析病毒种类。

2 结果与分析

2.1 葡萄病毒病发生情况及症状

对山东省烟台市、青岛市、日照市、潍坊市、临沂市、聊城市和德州市7个葡萄主产区进行调查，发现田间葡萄病毒病发生普遍，病株率在10%～30%，严重的苗圃田病株率可达60%以上。感病植株主要表現为花叶、叶片脉间褪绿、斑点黄化、叶缘卷曲、叶片皱缩、畸形（图1）。

2.2 山东省葡萄病毒病病原检测

对采集的186份病毒病疑似样品分别进行RNA提取和RT-PCR检测，结果表明，仅GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5种病毒被检出（图2），检出率分别为18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%（表2）。测序结果与GenBank中已报道的分离物序列一致性均在90%以上。

2.3 山东省葡萄病毒病分布情况

对山东省葡萄主产区采集的186份葡萄样品检测结果进行统计发现，不同地区间病毒病发生存在差异性，烟台、青岛平度、莱西、聊城东昌府和德州临邑等树龄较大的葡萄园以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染为主，新建葡萄园以GRSPaV、GFkV病毒侵染为主。复合侵染现象普遍，检出率为16.67%，复合侵染的组合方式有4种（表2）。

3 讨论与结论

葡萄繁殖方式主要为扦插和嫁接等无性繁殖，树体一旦感染病毒将终生带毒，给防治带来很大的困难[23]。近年来葡萄产业迅速发展，苗木流通日渐频繁，但由于引种时缺乏完善的病毒检测标准，大大增加了病毒感染几率，同时粗放的栽培管理模式，加速了病毒的蔓延[24]。因此，葡萄病毒病的早期检测工作不仅是无病毒苗木认证中的一项基础工作，也是防控葡萄病毒病的根本保障。

山东作为葡萄种植大省，在葡萄病毒病的防控技术研究上还存在大量空白。本研究对山东省葡萄主产区的主要病毒病发生情况和病原种类展开了系统性的调查和检测。结果表明，山东省葡萄主要病毒病为GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV和GFkV，以GFkV检出率最高，GFLV仅在两个区域检出，检出率仅为1.61%，各病毒的检出率无明显的区域性差异;烟台、青岛平度、莱西、聊城东昌府和德州临邑等树龄较大的葡萄园以GLRaV-1、GLRaV-3病毒为主，新建葡萄园以GRSPaV、GFkV病毒为主，这与潘志勇等[8]的研究结果不完全一致，表明近年来随着频繁引种，山东省新建葡萄园主要病毒病病原发生了显著变化。

复合侵染是病毒感染植物的一种常见现象，本研究结果表明山东省葡萄病毒病复合侵染现象普遍，检出率为16.67%，复合侵染的组合方式有4种，单个样品中最多可检出3种病毒。其中，GFkV参与3个类型的复合侵染，GRSPaV和GFkV的复合侵染比列最高，检出率为7.53%。结合前期的研究结果发现，葡萄病毒病多与葡萄类病毒病混合发生，加重了对葡萄的危害，严重影响葡萄产量和品质[24]。

综上所述，葡萄病毒病已成为制约山东省葡萄产业发展的一类重要病害。本研究明确了山东省葡萄主要病毒病的发生现状，为山东地区葡萄的引种、病毒病的早期检测及防治提供了技术支持与理论指导。

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