miR-451a和MMP-2蛋白在结直肠癌组织中的表达及对肿瘤细胞增殖的影响

倪浩亮 韩越俊 金晰函 杜金林

[摘要] 目的 探讨miR-451a和MMP-2蛋白在结直肠癌组织中的表达情况及两者对肿瘤细胞增殖的影响。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹分别检测结直肠癌组织与癌旁组织（来自2018年金华市中心医院手术切除的标本），多个肿瘤细胞系中miR-451a的表达和MMP-2蛋白的表达;在HCT116细胞系中过表达miR-451a（miR-451a-mimic）检测MMP-2蛋白表达;miR-451a-mimic或沉默MMP-2表达检测细胞增殖情况。结果 在结直肠癌组织中miR-451a表达明显下降，MMP-2蛋白的表达显著升高，这种结果同时出现在各个结直肠癌细胞株中，以HCT116细胞株最为明显;在HCT116细胞系中miR-451a-mimic显著减少MMP-2蛋白表达量，miR-451a-mimic或沉默MMP-2均会抑制肿瘤细胞的增殖。

结论 miR-451a在结直肠癌组织中表达明显降低，其本身可能通过抑制MMP-2蛋白的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。

[关键词] miR-451a;MMP-2;结直肠癌;增殖

[中图分类号] R735.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）09-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in colorectal cancer tissues and their effects on tumor cell proliferation. Methods Reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting were used to detect the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in multiple tumor cell lines in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues （from the specimens surgically resected by Jinhua Central Hospital in 2018）， respectively. The expression of MMP-2 protein was detected by over-expression of miR-451a（miR-451a-mimic） in HCT116 cell lines; cell proliferation was detected by miR-451a-mimic or by silencing MMP-2 expression. Results The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues significantly decreased， while the expression of MMP-2 protein significantly increased; this result was found in all colorectal cancer cell lines simultaneously， with the HCT116 cell line being the most obvious; miR-451a-mimic significantly reduced the expression of MMP-2 protein in HCT116 cell lines， and miR-451a-mimic or silencing MMP-2 inhibited the proliferation of tumor cells. Conclusion The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues is significantly reduced， which itself may inhibit the proliferation of tumor cells by inhibiting the expression of MMP-2 protein.

[Key words] miR-451a; MMP-2; Colorectal cancer; Proliferation

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因[1]。全世界约有50%的CRC患者死于远处转移[2-3]。尽管CRC的诊断和治疗有所改善，但每年有超过60万例患者死于CRC。近年来由于饮食结构和生活水平的改变，该病在我国发病率呈逐年上升趋势[4]。miR-451最早是由Altuvia等[5]在2005年从人脑垂体RNA中提取并命名，位于17q11.2染色体上。基质金属蛋白酶-2（matrix metal proteinase 2，MMP-2）参与肿瘤基底膜和细胞外基质的降解，与肿瘤关系密切，其高表达可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。文献报道显示miR-451能够抑制乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞肺癌中的细胞生长、增殖、侵袭和迁移[6-8]，但其在结直肠癌中表達及对结直肠癌细胞侵袭机制的研究不够充分。本研究将采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）分析结肠癌组织和癌旁组织中miR-451的表达差异，免疫组织化学法和Western blot检测结肠癌组织中MMP-2的蛋白表达情况，并探讨两者与结肠癌的相关性，以及共同参与细胞增殖抑制的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

12例结肠癌组织和癌旁组织取自2018年金华市中心医院手术切除的标本。所有患者术前均未接受过放化疗，术后病理诊断证实均为结肠癌Ⅱ期中分化腺癌。标本：男6例，女6例，本研究获得金华市中心医院伦理委员会批准，组织标本的收集均征得患者本人的知情同意。人结直肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480购自中国科学院上海细胞资源中心，人结肠正常黏膜上皮细胞株NCM60本实验室保存;过表达pcDNA-miR451a（pcDNA-miR-451a-mimic）、pcDNA-NC、psilencer-MMP-2pcDNA-MMP-2及对照质粒psilencer-Scr由上海吉凯生物公司构建，miR-451a RT PCR引物购自北京擎科有限责任公司;Lipofectamine TM 3000转染试剂盒购自Invitrogen公司;MMP-2抗体购自CST公司;GAPDH抗体、辣根酶过氧化物标记山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Realtime-PCR检测组织及各细胞系中miR-451a的表达  采用Trizol法提取癌组织、癌旁组织以及各细胞系的总RNA，首先加一定量Trizol，然后以5：1的比例加入氯仿，充分混匀，静置5 min，然后3000 rpm 4℃离心10 min，取上清加入异丙醇（根据Trizol量按2：1加）混匀静置10 min，3000 rpm 4℃离心5 min，去上清，加入75%乙醇洗涤，7500 r/min 4℃离心5 min，去上清，加入DEPC水溶解沉淀。根据OD260/OD280比值判断提取RNA的纯度，根据TAKARA逆转录试剂盒要求以5"-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3"引 物合成cDNA。按VazymemiRNA Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明，配制PCR反应体系，在定量PCR仪器上进行Realtime-PCR，最后用2-△△CT公式计算miR-451a表达量，并且采用内参基因u6作为内对照。

1.2.2 Western blot检测组织和各细胞系中MMP-2蛋白水平表达情况  取100 mg组织置入EP管中，并加入1 mL RIPA蛋白裂解液（已经加入蛋白酶抑制剂）。用电动匀浆器置于冰上匀浆，至肉眼不见块状组织为止，冰上充分裂解1 h，收集液体;取适量RIPA蛋白裂解液（加入蛋白酶抑制剂）加入6孔板中，机械破碎细胞，冰上充分裂解30 min提取液体。收集好的液体在3000 rpm 4℃条件下离心15 min，去沉淀，BCA法测浓度后置入-80℃储存备用。取稀释好的样品进行SDS-PAGE电泳（分离胶12%，浓缩胶5%），转膜，4℃封闭过夜。一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤后，再与HRP标记的二抗于室温孵育1 h，ECL显色，照相。

1.2.3细胞系中miR-451a-mimic检测MMP-2表达情况  细胞均用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DEME培养基在5%CO2、37℃细胞培养箱中进行培养。消化细胞收集到12孔板上，分别转染pcDNA-miR 451a、pcDNA-NC转染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，免疫印迹法检测MMP-2的蛋白含量，每组重复3次。

1.2.4 miR-451a-mimic或沉默MMP-2或同时miR-451a-mimic和MMP-2之后MTT法检测感染细胞的生存状况  消化适量细胞收集到96孔板上，每组设三个重复孔，待24 h后分别转染pcDNA-miR451a、psilencer-MMP-2、pcDNA-NC、psilencer-Scr以及同时转染pcDNA-miR451a和pcDNA-MMP-2，在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后在待测孔每孔加入适量MTT溶液，继续培养4 h后，弃培养液。每孔加入DMSO150 μL，避光震荡10 min，使结晶物充分溶解。测定570 nm处检测各孔吸光值（optical density，OD）。绘制对应时间的生长曲线。

1.3统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，双变量数据采用双因素变量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中miR-451a和MMP-2的表达水平

RT-PCR的结果显示，与癌旁组织相比，癌组织中的miR-451a表达水平显著下降，Western blot显示MMP-2蛋白表达量显著升高（图1、表1），在三个人结直肠癌细胞株中，miR-451a表达水平均显著下降，MMP-2蛋白表达量均显著升高，因此为了更好的研究其中机制，选取三种结直肠癌细胞系分别为HT29、SW480和HCT116来验证miR-451a和MMP-2在体外的表达。结果显示在三种结直肠癌细胞系中，miR-451a表达水平均下降，而MMP-2蛋白表达量均升高，尤其在HCT116细胞系中miR-451a表达水平下降最为明显，而MMP-2蛋白表达量则升高最为明显，差异均有统计学意义（P<0.05）（图2、表2）。进而我们选取HCT116细胞系来进行体外机制的验证。

2.3结直肠癌细胞系中miR-451a-mimic、沉默MMP-2对肿瘤细胞增殖的影響

在转染miR-451a-mimic质粒、沉默MMP-2质粒后，HCT116细胞在48 h后出现对细胞增殖的明显抑制作用，达到72 h时，抑制效果最为明显。HCT116细胞系中miR-451a-mimic其48 h和72 h抑制率分别为18.25%和37.23%，沉默MMP2基因后，48 h和72 h抑制率分别为29.54%和43.42%（图4、表3）。

3討论

miRNA以干扰mRNA翻译的方式负向调控基因的表达，能够与靶基因的3′端非转录区域特异性结合而导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后调控。其中miR-451a被发现与肿瘤的发生、发展有密切关系。Bandres E等[9]研究显示在胃癌和结直肠癌细胞株中，miR-451a-mimic可以有效降低巨噬细胞迁移抑制因子的mRNA和蛋白量，从而抑制肿瘤细胞的增殖、分化、浸润、转移和促进细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤发生、发展。除此之外，有文献指出[10]AMP活化蛋白激酶也是miR-451a的潜在作用因子，miR-451a-mimic能够抑制AMP活化蛋白激酶对雷帕霉素靶蛋白复合体1的激活作用，从而达到调节肿瘤生长的目的。

MMP-2是基质金属蛋白酶的一种，能对细胞外基质成分进行降解，这种作用是肿瘤侵袭、转移的重要条件[11-13]。MMP-2具有明胶酶的特性，可以在肿瘤浸润时，分解细胞外基质的通路，可以使细胞外基质重新排列，加速肿瘤的浸润及转移[14，15]。MMP-2的过度表达加强了恶性肿瘤的局部侵袭能力和远端转移能力，使病情进一步的恶化[16，17]。有研究显示在结直肠癌病变组织中MMP-2表达升高，明显异于正常的结直肠组织[18]。

有研究显示在胃癌细胞中MMP-2蛋白表达量受到miR-451a表达的影响，但在结直肠癌中尚未有足够的研究揭示这两者的关系[19，20]，本实验发现，在结直肠癌中miR-451a-mimic后发现MMP-2蛋白表达量相应的减少，证明MMP-2的表达确实受到miR-451a的影响，分别转染miR-451a-mimic以及抑制MMP-2的表达均会抑制肿瘤细胞的增殖，同时还发现，将miR-451a-mimic和MMP-2同时转染后，细胞增殖没有抑制，说明MMP-2蛋白恢复表达时，miR-451a-mimic并不能抑制癌细胞的增殖，可知miR-451a抑制结直肠癌细胞生长依赖于MMP-2的表达。

总而言之，miR-451a和MMP-2在结直肠癌发生发展中均分别扮演了关键角色，但其中MMP-2和miR-451a两者之间的相互关系及共同对肿瘤细胞的影响还未充分研究。本研究旨在探讨miR-451a和MMP-2两者在结直肠癌中共同发挥作用的联系，以阐明miR-451a作为抑癌因子具体的功能机制，为肿瘤个体化治疗提供帮助。本实验只能证实miR-451a表达可以抑制MMP-2表达，其中具体的机制还需要进一步探索。

[参考文献]

[1] Lancet T. Toward better control of colorectal cancer[J]. Lancet，2014，383（9927）：1437.

[2] Liu J，Li H，Sun L，et al. Epigenetic alternations of microRNAs and DNA methylation contribute to liver metastasis of colorectal cancer[J]. Dig Dis Sci，2019，64（6）：1523-1534.

[3] Zhang T，Guo J，Gu J，et al. Identifying the key genes and microRNAs in colorectal cancer liver metastasis by bioinformatics analysis and in vitro experiments[J]. Oncol Rep，2019，41（1）：279-291.

[4] Shen Y，Gong JM，Zhou LL，et al. MiR-451 as a new tumor marker for gastric cancer[J]. Oncotarget，2017，8（34）：56542-56545.

[5] Altuvia Y，Landgraf P，Lithwick G，et al. Clustering and conservation patterns of human microRNAs[J]. Nucleic Acids Res，2005，33（8）：2697-2706.

[6] Gits CM，van Kuijk PF，Jonkers MB，et al. MicroRNA expression profiles distinguish liposarcoma subtypes and implicate miR-145 and miR-451 as tumor suppressors[J].Int J Cancer，2014，135（2）：348-361.

[7] Tian Y，Nan Y，Han L，et al. MicroRNA miR-451 downregulates the PI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma[J]. Int J Oncol，2012，40（4）：1105-1112.

[8] Lopotová T，Zá■ková M，Klamová H，et al. MicroRNA-451 in chronic myeloid leukemia：miR-451-BCR-ABL regulatory loop？[J]. Leuk Res，2011，35（7）：974-977.

[9] Bandres E，Bitarte N，Arias F，et al. microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor produ-ction and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J]. Clin Cancer Res，2009，15（7）：2281-2290.

[10] Sun X，Lou L，Zhong K，et al. MicroRNA-451 regulates chemoresistance in renal cell carcinoma by targeting ATF-2 gene[J]. Exp Biol Med （Maywood），2017，242（12）：1299-1305.

[11] Li Z，Shan F，Ying X，et al. Laparoscopic versus open gastrectomy for elderly local advanced gastric cancer patients：Study protocol of a phase II randomized controll-ed trial[J]. BMC Cancer，2018，18（1）：1118.

[12] Agraval H，Ucs Y. MMP-2 and MMP-9 mediate cigarette smoke extract-induced epithelial-mesenchymal transition in airway epithelial cells via EGFR/Akt/GSK3β/β-catenin pathway：Amelioration by fisetin[J]. Chem Biol Interact，2019，314：108846.

[13] Santiago-Ruiz L，Buendía-Roldán I，Pérez-Rubio G，et al. MMP2 polymorphism affects plasma matrix metall-oproteinase（MMP）-2 levels，and correlates with the decline in lung function in hypersensitivity pneumonitis positive to autoantibodies patients[J]. Biomolecules，2019，9（10）：574.

[14] Lee KS，Shin S，Cho E，et al. nc886，A non-coding RNA，inhibits UVB-induced MMP-9 and COX-2 expression via the PKR pathway in human keratinocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2019，512（4）：647-652.

[15] Tsai MH，Wu CH，Lin WN，et al. Infection with staphylococcus aureus elicits COX-2/PGE2/IL-6/MMP-9-dependent aorta inflammation via the inhibition of intracellular ROS production[J]. Biomed Pharmacother，2018， 107：889-900.

[16] Shashni B，Nagasaki Y.Nitroxide radical-containing na-noparticles attenuate tumorigenic potential of triple negative breast cancer[J]. Biomaterials，2018，178：48-62.

[17] Xu H，Ren YJ，Liu K，et al. Correlations of serum VEGF and MMP-2 levels with CLM in CRC patients and effects of TACE on their expressions[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（11）：3394-3401.

[18] Ling L，Li Y，Li H，et al. MMP-2 and MMP-9 gene polymorphisms act as biological indicators for ulinastatin efficacy in patients with severe acute pancreatitis[J]. Me-dicine （Baltimore），2019，98（24）：e15831.

[19] Mashhadiabbas F，Neamatzadeh H，Foroughi E，et al. Association of MMP-2-753C>T and MMP-9-1562C>T polymorphisms with chronic/aggressive periodontitis risk：A systematic review and meta-analysis[J]. Iran J Public Health，2019，48（7）：1227-1238.

[20] Peyronnet B，Richard C，Bendavid C，et al. Urinary TIMP-2 and MMP-2 are significantly associated with poor bladder compliance in adult patients with spina bifida[J]. Neurourol Urodyn，2019，38（8）：2151-2158.

（收稿日期：2019-12-19）