姜黄素对小鼠肝癌细胞低密度脂蛋白受体基因表达的影响_低密度脂蛋白偏高怎么办
时间：2019-01-26 05:04:35 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要 目的:应用流式细胞仪定量分析药物对小鼠肝细胞低密度脂蛋白受体（LDL-R）表达的影响。方法:在小鼠肝癌细胞系Hca-F培养液中加入不同浓度的姜黄素培养24h。用DiI荧光素标记的低密度脂蛋白（DiI-LDL）与细胞孵育，通过流式细胞仪测定细胞对DiI-LDL的摄取量，定量分析姜黄素对肝癌细胞低密度脂蛋白受体基因表达的影响。结果:10～４0μmmol/L浓度的姜黄素能显著提高肝癌细胞低密度脂蛋白受体的表达量。结论:姜黄素具有上调低密度脂蛋白受体的表达作用。
关键词 姜黄素 肝癌细胞 低密度脂蛋白受体 基因表达 小鼠 流式细胞仪
血清低密度脂蛋白胆固醇酯(LDL-C)的增高是引起动脉粥样硬化及心血管疾病的主要危险因子之一。现在已很清楚低密度脂蛋白受体介导的内吞作用在低密度脂蛋白的代谢过程中起着重要作用。因此，通过药物调节低密度脂蛋白受体的表达是控制血浆低密度脂蛋白胆固醇酯水平的一个有效途径。近年的研究显示姜黄素具有显著降低血清脂质过氧化物，增加高密度脂蛋白胆固醇，降低血清总胆固醇含量水平，以及调节脂蛋白代谢相关酶活性的作用[1-3]。肝脏是LDL-C代谢的主要器官，肝细胞膜上有表达丰富的低密度脂蛋白受体。为探讨姜黄素调节血脂作用的分子机理，实验以小鼠肝癌细胞系Hca-F为材料，用姜黄素处理后，应用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪对肝细胞摄取胞外DiI-LDL，进行定性、定量分析。
1 材料与方法
1．1 材料：小鼠肝癌细胞系Hca-F购自中国科学院细胞库；PRMI-1640培养基（Lot#1165062）为美国Gibcobrl公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司；姜黄素为标准品，购自安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心；健康成人血浆购自浙江省中心血站；DiI荧光素（Lot#970807）购自美国Biotium公司；细胞培养板与培养瓶购自丹麦Nunclon公司；AKTA prime蛋白纯化系统为瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司产品；Biofuge stratos超速冷冻离心机为德国Heraeus公司产品；80MX超高速离心机为日本日立公司产品；激光扫描共聚焦显微镜和FACSort流式细胞仪（美国ABBOTT）。
1．2 DiI-LDL的制备：取健康成人血浆，用序列超速离心法,以NaBr调节密度至1．019g/ml，用RT50转头，40000r/min，4℃离心22h。上层为乳糜微粒（CM）和极低密脂蛋白（VLDL），小心吸去。将余下血浆用NaBr调节密度至1．060g/ml，同样条件离心22h，所得上层溶液即为LDL。小心收集至50ml离心管，共得15ml。将得到的LDL装入透析袋，在4℃冰箱中用1000ml含0．02%NaN�3的生理盐水透析，以除去高浓度的NaBr。12h换透析液1次，透析24h。取出后用聚乙二醇6000浓缩2h，最终得2ml浓缩液。进一步纯化使用Sepharose 6B柱，以含0．9%NaCl、0．02%NaN�30．01mol/L的PBS溶液作为洗脱液，用AKTA prime蛋白纯化系统分离蛋白质。分离条件：加样量：2ml；流速：0．3ml/min；收集：2ml/管；测定电压：1mV；走纸：0．2mm/min。对分离所得的第二个蛋白质洗脱峰用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析，证实该蛋白质确为LDL。根据记录仪所显示的LDL峰，取相应试管中的液体，合并为一管，共得34ml。将得到的LDL装入透析袋，再用聚乙二醇6000浓缩5h，得到10ml的LDL，以Folin-Lowrry氏法测定LDL蛋白质浓度。取2ml的LDL溶液与100mg不溶性马铃薯淀粉置于试管中涡旋震荡，然后加入60μl DiI(用甲醇溶解，浓度为10mg/ml)4℃放置1h，液氮迅速冷冻，真空干燥器冷冻干燥，然后加入2ml 10mmol/L的Tricine azide(pH8．2)，4℃冰箱中孵育48h，每隔一定时间取出混匀1次。4℃2000r/min离心15min，去淀粉沉淀。取上清，用Biofuge stratos超速冷冻离心机于4℃下12000r/min离心15min，取上清，重复离心1次，所得的上清含DiI-LDL，以Folin-Lowrry氏法测定上清液中的蛋白质浓度[4]。分装，充氩气，4℃保存（该试剂不可冰冻，4℃下可保存1～2个月）。
1．3 细胞培养与LDL的吸收测定：取一块24孔培养板，将小鼠肝癌细胞系Hca-F培养在含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，1．0×106个细胞/ml，2．5ml1640培养液/孔。实验设给药组、对照组、背景控制组。给药组（又分4组）：培养孔中分别加入姜黄素贮存原液，使其终浓度分别达到10、20、30、40μM。对照组和背景控制组不用姜黄素处理。24h后，各孔取1．5ml细胞液分别至1．5ml离心管中，3500r/min离心5min，去上清。各管加1ml无血清PRMI-1640培养液洗细胞2min，3500r/min离心5min，去上清。背景控制组，加1ml4%的甲醛固定细胞10min，使LDL受体功能失活。3500r/min离心5min,去上清。加1ml含15μg/mlDiI-LDL的无血清PRMI-1640培养液。其它各组分别直接加1ml含15μg/ml的DiI-LDL的无血清PRMI-1640培养液。各管在37℃下孵育4．5h，然后4℃下孵育0．5min，3500r/min离心5min,去上清。加1ml4%的甲醛固定细胞10min)。接着用PBS洗3次[5]。激光扫描共聚焦显微镜观察各组细胞，并用流式细胞仪定量测定细胞对DiI-LDL的吸收量。
2 结果
2．1 DiI-LDL配体荧光法检测结果：通过LDL-R介导的内吞作用，肝细胞能够吸收溶液中的DiI-LDL。细胞内积累的荧光染料量反映了细胞表面LDL-R的活性[6]。激光扫描共聚焦显微镜观察结果表明10～40μM浓度的姜黄素诱导具活性的LDL-R的表达，增加肝细胞LDL-R的活性（详见图1）。
2．2 流式细胞仪定量测定结果：应用流式细胞仪可检测和定量分析细胞对DiI-LDL的摄取量。结果表明10～40μmol/L浓度的姜黄素显著增加肝细胞LDL-R的活性(详见图2、图3)。
3 讨论
根据LDL受体介导的内吞途径，一个LDL受体往返细胞内外1周约需10min，因此在其20h的寿命中可以往返达数百次。这就意味着一个有功能的LDL受体可以摄取数百个LDL颗粒进入细胞。利用LDL受体的这一功能，我们可以通过对其配体LDL进行荧光素标记后，与细胞一起孵育，应用激光扫描共聚焦显微镜即可快速地定性检测，应用流式细胞仪则可方便、准确、
快速地进行定量分析。选用小鼠肝癌细胞系Hca-F，一方面，肝脏是LDL-C代谢的主要器官，肝细胞膜上有表达丰富的低密度脂蛋白受体。另一方面，Hca-F为悬浮培养细胞，非常适合用流式细胞仪分析。提高LDL-R的活性和降低血清LDL水平是防止动脉粥样硬化及心血管疾病的有效途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶是肝细胞合成胆固醇的限速酶。它的抑制剂，如他汀类，有些已作为降胆固醇药用于临床，但最近的研究表明，他汀类药物存在一些潜在的副作用，如肝损伤、肌痛、多发性神经疾病等[7-8]。
现代药理实验和临床试验也证明中药姜黄可以通过调节血脂水平而起到治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化症的作用，进一步的研究显示姜黄素是这一药物中最具活性的调脂化合物，并证明具有上调小鼠巨噬细胞[9]和人永生化淋巴细胞LDL受体基因表达的作用[5]。本实验进一步证明姜黄素是一个非常强的LDL受体基因表达促进剂，能极其显著地增加肝细胞对LDL的摄取。
如果病人的LDL-R都是没有活性的，那么仅仅增加其表达量是没有意义的。但是绝大数家族性高胆固醇血脂的患者是LDL-R缺陷型的杂合子。他们产生二分之一数量功能正常的LDL-R，他们血浆中LDL颗粒的数量比正常人平均要高2．5倍[10]。实验表明姜黄素足以能够将巨噬细胞和肝细胞的LDL-R数量调高1倍，从而降低异常升高的血浆LDL水平。很显然，姜黄素将是一个潜在的有效降胆固醇新药。
4 参考文献
［1］沃兴德，崔小强，唐利华.姜黄素对食饵性高脂血症大鼠血浆脂蛋白代谢相关酶活性的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2003，7(4):339-341.
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［3］Babu P.S. Srinivasan K. Hypolipidemic action of curcumin, the active principle of turmeric (Curcuma longa) in streptozotocin induced diabetic rats［J］. Mol Cell Biochem， 1997，166(1-2):169-75.
［4］范春雷，沃兴德，罗艳,等.姜黄素对爪蟾卵母细胞人LDL受体表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（5）：432-435.
［5］窦晓兵，范春雷，洪行球，等.姜黄素对人淋巴细胞人低密度脂蛋白受体表达影响的研究［J］.中国药学杂志，2005，40(13):980-982.
［6］Thierry Grand-Perret, Anne Bouillot, Aurélie Perrot, et al.SCAP ligands are potent new lipid-lowering drugs［J］. Nature Medicine ，2001， 7(12):1332-1338.
［7］Guis S., Bendahan D., Kozak-Ribbens G., et al. Rhabdomyolysis and myalgia associated with anticholesterolemic treatment as potential signs of m alignant hyperthermia susceptibility［J］. Arthritis Rheum 2003， 49: 2379-2388.
［8］Gaist D., Jeppesen U., Andersen M., et al. Statins and risk of polyneuropathy［J］. Neurology， 2002， 58:1333-1337.
［9］Fan Chunlei,Qian Ying,Wo Xingde,et al. Effect of Curcumin on the Gene Expression of Low Density Lipoprotein Receptors［J］. Chin J Integr Med，2005，11(3):201-204.
［10］Goldstein J.L，Brown M.S. The Cholesterol quartet［J］. Science ，2001， 292(5520):1310.
收稿日期 2007-05-16
