三叶 五叶木通提取物药效及对药酶影响的比较研究 三叶木通和五叶木通
时间：2019-01-26 04:50:36 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：目的：比较三叶木通［Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz，简称AK］和五叶木通［Akebia quinata（Thunb）Decne，简称AD］水提物抗炎、利尿及抗菌作用的同时，探索性观察了两种木通对细胞色素P4503A（CYP3A）活性和P-糖蛋白（P-gp）水平的影响。方法：抗炎作用采用小鼠腹腔毛细血管通透法和小鼠耳肿胀法，观察其抗炎作用；利尿作用采用大鼠代谢笼法，观察其利尿作用；采用体外抑菌实验,观察其抑菌作用。用聚乙二醇制备肝微粒体，测定肝和小肠CYP3A活性；以免疫组化法检测肝和小肠组织P-gp水平。结果：两种木通均明显抑制小鼠腹腔毛细血管炎性渗出,抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀;并利尿和抑菌作用明显；三叶木通对肝脏CYP3A活性和P-gp水平有一定的抑制作用。与正常对照组相比差异显著（P＜0.05）；五叶木通对肝脏CYP3A活性和P-gp水平无明显作用，与正常对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。结论：两种木通抗炎、利尿及抑菌作用基本相等；三叶木通水提物可能是肝CYP3A和P-gp的抑制剂；但五叶木通对CYP3A和P-gp影响不明显。
关键词：三叶木通和五叶木通水提物；药效；CYP3A；P-gp；比较研究
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0732-04
三叶木通和五叶木通是临床常用的利尿通淋药。两种木通均是本草记载的正品木通，1963年版《中国药典》收录过五叶木通，但因药源短缺，在以后各版药典已删去五叶木通。从2002增补版开始《中国药典》已收录三叶木通。因此，比较两种木通的疗效、观察两种木通对药酶的影响及两者相互替代问题是医药工作者值得关注的问题。本研究就比较两种木通水提物抗炎、利尿及抑菌作用，并从CYP3A、P-gp切入尝试性的探讨比较了两种木通对药酶的影响，为两种木通的相互替代及合理应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料和试剂
1.1.1动物雄性Wistar大鼠，体重（220±10）g、雄性ICR小鼠，体重（22±2）g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。合格证号：SCXK（京）2002-003。
1.1.2药物与试剂三叶木通和五叶木通水提物由北京医科大学医学部药学院提供。P-gp一抗由北京莫克公司提供。二抗由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。3% H2O2、免疫组化用PBS、聚乙二醇6000、DAB、乙酰丙酮、二甲苯、醋酸、伊文思兰、甲醛、考马斯亮蓝均由北京化学试剂公司提供。红霉素、NADP、6-磷酸葡萄糖二钠，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(XV,Sigma)4U/ml）由北京科昊达生物提供。消炎痛胶囊由河北永丰药业有限公司提供。金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌、白色念珠菌，由北京中医药大学基础医学院医学病原系提供。
1.1.3仪器设备高速低温离心机，匀浆器，分光光度计（上海分析仪器厂），打孔器，图像分析仪，排水法测定鼠爪体积装置。
1.2实验方法
1.2.1两种木通水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响取ICR小鼠160只。按体重随机分为8组，即模型组、消炎痛组（7mg/kg）、三叶木通水提物大、中、小3个剂量组（117.94mg/kg、58.97mg/kg、29.48mg/kg）、五叶木通水提物大、中、小3个剂量组（182.06mg/kg、91.03mg/kg、45.5mg/kg）每组11只。动物灌胃给药，每天1次，连续5天。末次给药后1h，以二甲苯50μL涂抹小鼠右耳，30min后拉颈处死，用8mm打孔器将小鼠双耳同部位等面积切下，以电子天平称重。左耳为对照，计算右耳炎症增重百分率，结果进行统计学处理。
1.2.2两种木通水提物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响取ICR小鼠160只。按体重随机分为8组，即模型组、消炎痛组（7mg/kg）、三叶木通水提物大、中、小3个剂量组（117.94mg/kg、58.97mg/kg、29.48mg/kg）、五叶木通水提物大、中、小3个剂量组（182.06mg/kg、91.03mg/kg、45.5mg/kg），每组11只。动物灌胃给药，每天1次，连续5天。末次给药后30min，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2mL,30min后尾静脉注射0.5%伊文氏蓝生理盐水0.1mL/10g,20min后处死小鼠,剪开腹腔,每次用2mL生理盐水冲洗腹腔3次,用吸管吸取腹腔洗出液5～6mL,1000r/min离心5min,取上清液在分光光度计590nm处测定吸收度, 进行统计学处理,并计算渗出抑制率。
1.2.3大鼠利尿实验取Wistar大鼠120只。按体重随机分为8组，即模型组、氢氯噻嗪组（10mg/kg）、三叶木通水提物大、中、小3个剂量组（74.3mg/kg、37.15mg/kg、18.575mg/kg）、五叶木通水提物大、中、小3个剂量组（104.7mg/kg、57.35mg/kg、28.675mg/kg），每组8只。动物灌胃给药，每天1次，连续4天。禁食18h，第5天模型组水负荷给予生理盐水50mL/kg灌胃，各用药组将药物加于负荷的生理盐水50mL/kg中同时灌胃。实验开始时，轻压动物下腹部，排尽余尿。将动物放入代谢笼中，每小时收集尿液1次，连续观察6h。
1.2.4试管稀释法将两种木通水体物原液在试管内用营养肉汤作连续对倍稀释（每试管总量为1mL），抑制细菌的药物最终浓度为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL；再于各试管中加入一定量实验菌稀释液（每试管加菌液10μL），37℃，18h培养，与阴性对照管对比，再转种于固体培养基，观察有无细菌生长，测定药物的最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）。
1.2.5两种木通对CYP3A和P-gp的影响取ICR小鼠30只。按体重随机分为正常对照组、三叶木通水提物组（58.97mg/kg），五叶木通水提物组（91.03mg/kg），每组10只。给药组给相应的药物，正常对照组给等容量的生理盐水。每天1次，连续10天。末次给药后，动物禁食过夜，断头处死，迅速打开腹腔和胸腔，取肝脏和小肠组织待测CYP3A和P-gp。
（1）微粒体制备：取肝脏和小肠组织，用预冷0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗后，用滤纸吸，称重，1∶4比例加0.1mol/L磷酸缓冲液，用电匀浆器匀浆。在高速离心机上离心（9000r/min）15min后，取上清液加入终体积为8.5%的50% 聚乙二醇溶液，10000r/min离心20min，沉淀部分用50%聚乙二醇漂洗1次，10000r/min离心20min，弃去上清液，所得微粒体悬浮于含有30%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中,分装后-80℃保存。整个过程要在1-4℃低温中进行[1]。
（2）蛋白含量测定：以小牛血清白蛋白为标准品采用考马斯亮蓝法测定微粒体蛋白含量。
（3）CYP3A活性的测定：参照有关文献[2]，用红霉素脱甲基活性测定法进行活性测定。取相当于0.4mg微粒体蛋白的肝微粒体匀浆分别加入不同管中，在每只试管中加入4mmol/L的NADPH 0.05mL，0.01mmol/L的磷酸缓冲液0.25mL，然后用蒸馏水定容至0.5mL；各试管中红霉素的浓度都是0.4mmol/L。37℃温孵20min，然后加入25%硫酸锌溶液0.05mL，混匀。终止反应后，离心，上清液中加入Nash试剂，50℃温孵0.5h后，测溶液在420nm处的吸光度，计算细胞色素P4503A的活性。
（4）肝和小肠P-gp水平的测定：取肝、小肠组织放入4%多聚甲醛中浸泡12h后，PBS充分冲洗。常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。以免疫组化法进行染色；用显微图像分析仪进行数据分析。
1.3统计学方法
实验数据采用SAS6.12软件进行统计学分析，计量资料均数用 ±s表示，并用t检验作差异的显著性分析。
2结果
2.1两种木通水提物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
两种木通水提物均能显著抑制二甲苯致炎症反应，与模型组和阳性对照组相比差异显著（分别为P
