汉族、哈萨克族湿热痹阻证类风湿关节炎患者Wnt信号通路的研究

陈慕芝 王璞玉 照日格图

【摘 要】目的：检测汉族、哈萨克族湿热痹阻证类风湿关节炎患者Wnt信号通路基因，以期发现不同民族类风湿关节炎患者在Wnt信号通路上的表现机制是否存在差异，为进一步研究类风湿关节炎的发病机制及临床治疗提供理论依据。方法：运用PCR Array技术对4例哈萨克族和4例汉族湿热痹阻证类风湿关节炎患者的Wnt基因进行检测，筛选出表达差异有统计学意义且与类风湿关节炎发病相关的基因，再选取哈萨克族（试验组）与汉族（对照组）湿热痹阻证类风湿关节炎患者，每组30例，应用实时荧光定量PCR技术对其外周血进行检测，进一步验证所筛选出的Wnt基因表达差异。结果：试验组与对照组相比，有21个Wnt基因表达差异有统计学意义（差异倍数 > 2，P < 0.05）。从中选出FZD9、MMP7、Wnt8A、Wnt1和Axin2基因，用实时荧光定量PCR技术进一步验证，发现这5个基因在试验组中均呈现高表达，2组间Wnt8A、Axin2和Wnt1比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：哈萨克族与汉族湿热痹阻证类风湿关节炎患者相比，Wnt8A、Axin2和Wnt1基因存在显著差异，且呈正向倍数变化，这些基因的异常表达可能与哈萨克族类风湿关节炎患者发病特点有关。

【关键词】 关节炎，类风湿;湿热痹阻证;Wnt信号通路;汉族;哈萨克族

【ABSTRACT】Objective：To detect Wnt signaling pathway gene in patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome among the Han and Kazak nationalities，in order to find out whether there are differences in theexpression mechanism of Wnt signaling pathway among different nationalities，and provide theoretical basis for further research onthepathogenesis and clinical treatment of rheumatoid arthritis.Methods：PCR Array technology was used to detect the Wnt geneof four Kazak patients and four Han patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome .Another sixty patients（thirty of each nationality）were selected as the experiment group（Kazak）and the control group（Han），and their peripheral blood was detected by real-time fluorescence quantitative PCR to further verify the expression difference of the screened Wnt gene.Results：Compared with the control group，the expression of twenty-one Wnt genes in the experiment group was significantly different（difference multiple > 2，P < 0.05）.Five genes，i.e.FZD9，MMP7，WNT8A，WNT1 and AXIN2 were selected and further verified by real-time fluorescence quantitative PCR.It was found that these five genes were highly expressed in the experiment group.There were statistically significant differences between the two groups in WNT8A，AXIN2and WNT1（P < 0.05）.Conclusion：There are signifi-cant differences in WNT8A，AXIN2and WNT1 genes between Kazak and Han patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome，and the abnormal expression of these genes may be related to the pathogenesis of Kazak patients with rheumatoid arthritis.

【Keywords】arthritis，rheumatoid;dampness-heat-bi-obstruction syndrome;Wnt signaling pathway;Han nationnality;Kazak

類风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，主要侵犯全身多关节，临床表现为慢性、对称性多关节的肿胀、疼痛，严重者可导致关节畸形以及功能的丧失[1]。其基本病理改变为关节的滑膜炎、血管翳的形成，进而导致关节骨及软骨的破坏，严重影响患者正常生活[2]。我国RA发病率约为0.4%，发病年龄20～45岁，女性更为常见[3]。RA属中医学“痹证”范畴，课题组前期对新疆哈萨克族RA患者临床资料分析发现，与汉族相比，哈萨克族RA患者中医证型以湿热痹阻证多见，且疾病活动度较高，病情表现较重，更易出现免疫功能紊乱[4]。

RA的病因较复杂，一般认为是在遗传易感性的基础上，受性激素、环境、社会、生理、心理等因素相互作用，机体免疫功能紊乱，而引起的慢性炎症[5]。成纤维样滑膜细胞（FLS）、细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌增加在其发病中起重要作用[6]。研究表明，Wnt信号转导途径不恰当激活与RA的发病密切相关[7]。因此，对Wnt信号通路的深入研究，不仅有助于进一步了解RA的发病机制，还能为研究治疗RA的药物提供新的思路。在此基础上，笔者运用PCR Array技术检测汉族、哈萨克族湿热痹阻证RA患者Wnt信号通路基因，以期发现不同民族RA患者在Wnt信号通路上的表现机制是否存在差异，为进一步研究RA的发病机制及临床治疗提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017年6月至2018年6月在新疆医科大学附属中医医院风湿科住院的患者。首先选取4例哈萨克族（男2例、女2例）和4例汉族（男2例、女2例）湿热痹阻证RA患者，用PCR Array技术对Wnt基因进行检测，筛选出表达差异有统计学意义且与RA发病相关的基因，再选取哈萨克族与汉族湿热痹阻证RA患者各30例，用实时荧光定量PCR对其外周血进行检测，进一步验证所筛选出的Wnt基因表达差异。30例哈萨克族湿热痹阻证RA患者设定为试验组，男10例，女20例;年龄22～75岁，平均（48.80±11.21）岁。30例汉族湿热痹阻证RA患者设定为对照组，男6例，女24例;年龄30～75岁，平均（53.97±12.25）岁。2组患者在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经新疆医科大学附属中医医院伦理委员会审批（批号2016XE0129-1）。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 按照2010年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的RA分类标准[8]。

1.2.2 中医证型标准 按照《实用中医风湿病学》[9]中湿热痹阻证的诊断标准。

1.3 纳入标准 ①符合上述西医诊断标准和中医证型标准;②年龄18～75岁;③患者知情同意。

1.4 排除标准 ①重叠其他风湿病者;②重度心肺功能不全者;③肝、肾、造血系统等严重原发性疾病者;④妊娠或哺乳期妇女;⑤精神病患者。

2 方 法

2.1 观察项目 ①临床症状及体征：关节疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分、晨僵时间、疾病活动度评分（DAS28）、关节功能分级。②实验室检查指标：白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（Hb）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、C-反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、补体（C3、C4）、红细胞沉降率（ESR）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）、抗角蛋白抗体（AKA）、类风湿因子（RF）、纤维蛋白原、D-二聚体（DD）、凝血酶原时间等。实验室检查项目均由本院检验科完成。

2.2 Wnt信号通路基因检测

2.2.1 PCR Array实验步骤 RNA的提取、反转录、PCR Array步骤均按照说明书进行，用核酸蛋白定量仪检测RNA浓度、A260/A280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

2.2.2 荧光定量实验（RT-PCR）步骤 提取RNA，进行纯度检测，用质量分数为1.8%的琼脂糖凝胶电泳，150 V，14 min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察结果，RNA检测均合格。荧光定量引物信息参照表1，PCR热循环参数：95 ℃2 min，95 ℃ 5 s（40个循环），60 ℃30 s（40个循环），60 ℃延伸30 s。

2.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 Wnt信号通路差异基因结果

3.1.1 Wnt信号通路PCR Array结果 仅选取差异有统计学意义（P < 0.05）的基因，结果见表2。

3.1.2 RT-PCR检测结果 应用RT-PCR检测PCR Array结果中筛选出的5个差异基因（FZD9、MMP-7、Wnt8A、Axin2、Wnt1）mRNA水平分析，结果表明，5个差异基因都呈现正向倍数变化;其中，2组间Wnt8A、Axin2、Wnt1比较，差异有统计学意義（P < 0.05）。见表3。

3.2 2组患者一般资料、临床症状及体征比较2组患者在病程、VAS评分、关节晨僵时间、DAS28评分、关节功能分级等方面比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3.3 2组患者实验室指标比较 2组患者血常规中RBC、PLT、Hb水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;2组ESR水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;其余生化指标、免疫球蛋白水平、补体水平、凝血测定各项指标、CRP、抗CCP抗体，及AKA、RF阳性率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表5、表6。

4 讨 论

本研究发现，2组患者RBC、PLT、Hb、ESR  水平比较差异有统计学意义（P < 0.05）。有研究表明，RA患者的RBC水平降低与炎症、免疫等指标的升高具有相关性，WBC水平升高可作为RBC值降低的危险因素，参与RA的发病及病情活动[10]。PLT与RA患者晨僵时间、DAS28评分、VAS评分、ESR等指标均呈显著正相关，PLT可作为RA疾病活动度的灵敏指标之一[11]。本研究结果提示，哈萨克族与汉族RA患者在病情活动性方面存在差异。

本研究发现，哈萨克族湿热痹阻证RA组与汉族湿热痹阻证RA组相比，FZD9、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt1这5个差异基因均呈现正向倍数变化，其中，Wnt8A、Axin2、Wnt1这3个基因差异有统计学意义（P < 0.05），且在哈萨克族湿热痹阻证RA组中呈高表达。

Wnt信号通路由Wnt配体蛋白、细胞膜上相应的受体、胞内信号传导部分和细胞核内的核转录调控因子构成，可分为依赖β-连环蛋白（β-caternin）的经典Wnt信号途径和不依赖β-caternin的非经典Wnt信号途径。Wnt配体蛋白家族可以分为Wnt1类和Wnt5a类，Wnt1类蛋白包括Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wnt8b;Wnt5a类蛋白有Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b和Wnt11[12]。其中，Wnt1、Wnt8a/b和Wnt10a等能激活經典途径[13]。研究发现，Wnt信号通路的激活有助于RA中FLS的活化，增加的Wnt1等可诱导白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎细胞因子和MMP3的产生，导致炎症的发生[14]。

Axin2是经典Wnt信号通路的负调节因子，通过与APC、CKIα、GSK-3β结合形成的复合物，使β-caternin磷酸化被降解，从而抑制Wnt信号通路。在正常细胞中β-catenin处于较低的水平，以保证关节软骨细胞正常增殖、分化和凋亡[15]。若β-catenin水平过高，会促进软骨细胞过度增殖分化，引起骨赘的形成;β-catenin水平过低，会抑制软骨细胞的增殖分化，导致骨质疏松的发生，因此，调控Axin水平可以间接控制软骨细胞的生长水平[16]。

Wnt信号通过卷曲蛋白（frizzled，Frz）家族转导，Frizzled家族包括10个跨膜受体和单跨膜共受体启动典型和非典型信号级联[17-18]。FZD蛋白家族是含有7次跨膜结构域的Wnt信号通路受体，负责识别和固定Wnt蛋白，并将信息传递到细胞膜内[19]。研究发现，FZD9能通过非经典Wnt信号途径正向调节骨重塑，在骨折愈合期能正向调节骨修复[20]。

基质金属蛋白酶（MMPs）家族是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶家族，对细胞外基质（ECM）的降解、组织重建以及细胞内多种可溶性因子的调控起重要作用。在正常生理状态下，MMP与组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）共同调控ECM的更新，维持细胞的稳定性。MMP-7是Wnt信号通路的下游靶基因之一，参与细胞增生与凋亡等过程。MMP广泛存在于结缔组织中，对ECM的生理病理作用起调节作用。正常生理情况下，软骨细胞产生的MMP和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）保持相对平衡，维持了关节软骨基质的合成降解平衡，保证了关节软骨的正常[21]。当滑膜发生炎症时，MMP的量或者活性增加，MMP能直接参与骨与软骨的降解，促进血管的生成，微血管基底膜及间质成分降解，最终导致关节软骨的破坏。

非经典Wnt信号途径能诱导产生炎性因子，促进骨质破坏，Wnt5通过活化FLS促使RA患者体内产生更多的炎症趋化因子[22]。移除关节滑液中的Wnt7B时，IL-6、TNF-α等炎性因子表达减少，导入Wnt7B时，相关炎性因子表达增多，进而加重RA病情[23]。李里等[24]通过Wnt信号通路对RA大鼠炎性因子的影响研究发现，炎性因子在RA发病中呈高表达，阻断Wnt信号通路可显著抑制炎性因子。Wnt信号通路的异常激活可能导致炎性因子高表达，进而加重RA病情。

综上所述，汉族、哈萨克族湿热痹阻证RA患者外周血Wnt信号通路中差异表达基因主要有FZD9、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt15种，其中Wnt8A、Axin2和Wnt1基因存在显著性差异，且在哈萨克族RA组中均呈高表达，考虑这些基因的异常表达可能与哈萨克族湿热痹阻证RA患者疾病特点有关。与汉族RA患者相比，哈萨克族RA患者可能由于Wnt基因过表达，更易导致Wnt信号通路的异常激活，诱导多种炎症细胞因子的产生，加重了哈萨克族RA患者炎症表现，使MMP表达量增高，促进血管翳的生成，进而加重关节软骨的破坏，加重患者病情。

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收稿日期：2019-11-12;修回日期：2020-01-17