【柳树叶提取物诱导肝癌细胞株ｈｅｐ－Ｇ２凋亡的实验研究】白柳树皮提取物

　　摘要 目的：研究柳树叶水提物抗肿瘤作用，为最终提取一种有效抗肿瘤药物及临床前实验提供依据。方法：柳树叶水提物制备药物血清作用于培养的肝癌细胞株hep-G2，检测其凋亡。采用端粒重复序列扩增（TRAP）法结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测端粒酶活性。结果：柳树叶水提物制备药物血清对靶细胞有明显的抑制生长现象。孵育一段时间后，能使肝癌细胞发生凋亡，并呈现对浓度的依懒性和伴随端粒酶活性下降。结论：柳树叶提取物能诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡。
　　关键词 柳树叶提取物 肝癌细胞株hep-G2 肿瘤细胞凋亡 实验研究
　　
　　柳树叶中含有挥发油和大量糖苷类化合物及酚类化合物，其水提浸膏早已被证实具有消炎止痛、活血化瘀的作用[1]，常用于外用药的组方中，用于治疗跌打损伤、腰肌劳损等病症，近年来还用于治疗癌性疼痛。国外有研究表明柳枝水萃取物能够显著抑制肿瘤细胞生长[2]，但机理尚不明确。本实验研究以肝癌细胞株hep-G2作为靶细胞，探讨柳树叶水提物诱导其凋亡的可行性。用柳树叶水提物对SD大鼠灌胃，制备药物血清，将药物血清加入体外培养液中进行肝癌细胞株hep-G2培养。观察药物血清对肿瘤细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 药物血清的制备：分述如下。
　　1．1．1 实验材料：柳树叶水提物、SD大鼠、注射器、灌胃针、解剖剪、解剖镊、无菌试管、微孔滤膜、吸管、橡皮头、台式低速离心机、冰箱、真空干燥灭菌柜。
　　1．1．2 实验步骤：①柳树叶水提物分高浓度(15mg/kg,即每千克SD大鼠灌15mg柳树叶水提物)、中浓度（10mg/kg）、低浓度（5mg/kg）对SD大鼠进行灌胃。对照组用生理盐水灌胃，每组6只SD大鼠。②3周后于无菌条件下分别打开灌胃过的SD大鼠腹腔，由下腔静脉抽血，同组大鼠血装于事先编号的同一无菌试管内，混匀。血液在室温下放置3h，使血液凝固，然后移至4℃冰箱中过夜，使血清充分析出。③第2天将各试管血清在4℃，4000r/min条件下离心20min,使血清析在上层，吸取另装，然后用0．22um的微孔滤膜过滤除菌，再放于真空干燥灭菌柜里53℃灭火30min后，保存于-20℃冰箱待用。
　　1．2 细胞培养：分述如下。
　　1．2．1 实验材料：超净台（TH-420）、二氧化碳培养箱（For ma311）、低速台式离心机（Beckman）、倒置显微镜（SANYO）、培养瓶、无菌吸管、橡皮头、试管架、酒精灯、酒精棉球、废液缸、标记笔、灭菌工作服、口罩、帽子、磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞消化液（0．25%胰蛋白酶）、细胞培养液（含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基）、含100ml/L药物血清和对照血清的RPML1640培养液、肝癌细胞株hep-G2、细胞计数板。
　　1．2．2 实验步骤：①将药物血清和对照血清分别配成100ml/L的RPML1640培养液备用。②将hep-G2细胞培养于RPMI1640培养液中放于二氧化碳培养箱（37℃，5%CO�2，饱和湿度）中培养。③从培养箱中取出培养瓶，显微镜下观察。当细胞培养瓶中的细胞长成致密单层时，在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中旧培养液，加入1~2ml 0．25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），室温静置2~10min,于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时则吸去胰蛋白酶液，加入新培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，直至瓶壁细胞全部脱落下来为止。再轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散，吸取1ml细胞液，将细胞液滴于细胞计数板上记数。将剩余细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡后，将离心管放入台式离心机中，以1000r/min离心5min。弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，根据记数结果将细胞悬液分装于2~3个培养瓶中，使每个培养瓶接种上约106个细胞，再加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内，放入培养箱中培养，预培养24h。然后分别换药物血清培养液和对照组培养液培养6d。将经药物血清作用过的hep-G2分成两份，一份采用Annexin-v法对肝癌细胞进行Annexin-v和PI双染色，上流式细胞仪检测，观察药物血清对肿瘤细胞凋亡的影响。再采用端粒重复序列扩增（TRAP）法，对另一份hep-G2进行检测，观察药物血清对体外培养的hep-G2的端粒酶活性的影响。
　　1．3 细胞凋亡检测：分述如下。
　　1．3．1 实验材料：流式细胞仪（Bdlsrfsc）�低速台式离心机（Beckman）�吸管�试管�离心管�试管架�PBS液�Annexin V/PI试剂盒。
　　1．3．2 实验步骤：将经药物血清培养液和对照组培养液培养了6d的细胞经细胞记数各约取7×10�5细胞，各加入2ml冰冷PBS，吸管轻轻吹打均匀，吸入10ml离心管中，将离心管放入台式离心机中以1000r/min离心5min，弃上清，再加入冰冷PBS液重复上述实验两次。再在各管中加入100μl Binding Buffer和10μl FITC标记的Annexin-V（20μg/ml），室温避光30min，再各加入PI（50μg/ml）5μl，避光反应5min后，各加入400μl Binding Buffer，立即上流式细胞仪检测（一般不超过1h）,同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
　　1．4 端粒酶活性检测：分述如下。
　　1．4．1 实验材料：PCR仪（Hybrid）�低速离心机(Beckman)�水浴锅�低温冰箱�TRAP-eze端粒酶检测试剂盒�1×CHAPS裂解缓冲液�10×Buffer�dNTP TS Primer TRAP Primer Mix�Tap酶端粒酶�电泳仪，电泳槽。
　　1．4．2 实验步骤：将经药物血清培养液和对照组培养液培养了6d的细胞经细胞记数各约取7×10�5个细胞分别置于事先编好号的试管中，各加入1×CHAPS裂解缓冲液200μl,冰浴30min后，于14000r/min4℃离心30min后吸取上清液，速冻于－70℃低温冰箱中，采用考马斯亮蓝G-250染色法对提取的产物进行蛋白定量，使TRAP反应时蛋白定量为0．5μg。端粒酶活性检测采用Oncor公司的TRAP-eze端粒酶检测试剂盒。在50μl PCR总反应体积中各加入5μl 10×Buffer；1μldNTP,1μl TS Primer,1μl TRAP Primer Mix;2μl Tap酶端粒酶混合物30℃温浴30min后，按94℃30s,60℃30s程序于PCR仪中扩增30个循环。取25μlPCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 FITC-Annexin v/PI法检测细胞凋亡：细胞凋亡结果见表1。由表1可看出，随着药物血清浓度的升高，凋亡细胞和死亡细胞数量也增加。但当药物血清浓度高到一定程度时，凋亡细胞数又减少了，而死亡细胞则大大增加，与对照组相比均有显著性差异（P＜0．05,P＜0．01）。
　　
　　注：从右到左，第1，2孔为经低浓度药物血清作用的细胞端粒重复序列检测结果，第3、4、5孔为经中浓度药物血清作用的细胞端粒重复系列检测结果，第6、7、8孔为经高浓度药物血清作用的细胞端粒酶系列检测结果。第9孔为未经任何药物作用的肝癌细胞端粒酶检测检测结果。第10孔位对照组。
　　
　　2．2 端粒酶活性检测：检测结果见图1。由聚丙烯酰胺凝胶电泳条带可看出经药物作用的肝癌细胞，其端粒重复序列
　　TTAGGG扩增产物较少，甚至没有，并随药物浓度的增加其扩增产物越少，亦即端粒酶活性较低。这说明柳树叶提取物制备的药物血清对肝癌细胞hep-G2的端粒酶是有影响的，它降低了端粒酶活性。
　　
　　3 讨论
　　
　　近年来，随着分子生物学�细胞遗传学及免疫学的进展，更多的药理研究建立在这些先进的研究手段之上，不但在细胞水平而且在分子水平提示了药物的抗肿瘤机制。从取得的成绩看来，抗肿瘤中药的突破在于对单药、单种成分药理机制阐明。包括干扰蛋白合成，抗细胞有丝分裂，干扰细胞增殖周期和诱导分化，凋亡等几个方面，其中诱导细胞凋亡是目前研究的最多的。通过基因调控，包括诱导、启动，实施细胞凋亡，是细胞主动消亡的过程。迄今为止，许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。最近有报道，英国Nabha等[2]用非洲柳树的提取物，在体外实验中能明显抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡。国内尚未开展类似的研究工作，更未见有关柳树叶提取物用于抗癌的报道。但国内已进行过柳树药用成分的提取，用于癌性镇痛。当前对柳树叶中有效抗肿瘤组分及其抗肿瘤机理尚不清楚。柳树在我国是普遍生长的一类树种，通过本研究，不仅可以探讨柳树抗肿瘤的机理，指导临床用药，也为抗肿瘤药研究开发提供了新思路，对推动我国医药行业的发展具有积极的作用。
　　从本实验结果看来，柳树叶水提物制备药物血清，对体外培养的肝癌细胞是有影响的，能促进细胞凋亡，并随着浓度的增加细胞凋亡数也增多。但当药物血清浓度高到一定程度时，凋亡细胞数又减少了。这是因为，当药物浓度高到一定程度时，药物对细胞毒性影响大，死亡细胞数增加，所以凋亡细胞相对减少。柳树叶水提物制备药物血清，对体外培养的肝癌细胞是有影响的，能促进细胞凋亡，并随着浓度的增加细胞凋亡和死亡数量也增多。
　　近年来中药不管是单方中药，复方中药还是中药有效成分，其对影响端粒酶活性的研究较多[3-4]。张莉萍等[5]人采用PCR-Elisa法研究苦参碱对K562细胞端粒酶活性的影响，结果显示苦参碱作用后的K562细胞端粒酶活性明显受抑制。范钰等[6]人应用端粒重复扩增-微孔板杂交法研究了活血化瘀中药莪术提取物榄香烯乳对胃癌SGC-7901细胞株端粒酶活性的影响，对端粒酶进行了半定量检测。结果细胞株端粒酶活性下降，并随榄香烯乳浓度增加抑制作用越明显。刘坚等人用药物血清和细胞学方法观察了10％搏癌丸药物血清作用于人肝癌细胞Hep-G2 48h后对端粒酶活性的影响，结果Hep-G2细胞端粒酶活性受到明显的抑制。本实验采用端粒重复序列扩增（TRAP）结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法观察药物血清对体外培养细胞的端粒酶活性的影响。从实验结果可知，肝癌细胞的端粒酶活性下调了，并且随着药物血清浓度的增加，端粒酶活性越弱，表明药物很可能通过抑制端粒酶活性从而诱导细胞凋亡。
　　综上所述，柳树叶水提物制备的药物血清能够抑制体外培养的肝癌细胞(hep-G2)的增长，并诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞端粒酶活性。我们将对柳树叶提取物在抗肿瘤治疗作用中做进一步的研究，使其抗肿瘤作用在临床得到应用，造福广大肿瘤患者。
　　
　　4 参考文献
　　［1］林曦，卢再红.柳枝中药用成分的研究［J］.杭州应用工程技术学院学报,2001,13(1):19，211.
　　［2］Nabha SM, Mohammad RM, Dandashi MH et.al Combretastatin-A4 prodrug induces mitotic catastrophe in chronic lymphocytic leukemia cell line independent of caspase activation and poly(ADP-ribose) polymerase cleavage［J］. Clin Cancer Res 2002 Aug，8(8):2735.
　　［3］孟志强,郭伟剑,于尔辛,等.健脾理气方药用血清对肝癌细胞端粒酶活性及凋亡的影响［J］.世界华人消化杂志，2001,10（1）:23-25.
　　［4］苏勉诚,吕晓英,李红坤,等.癌宁诱导体外人胃腺癌细胞SGC-7901凋亡及细胞周期的研究［J］.中药材，2001,24（12）：876-878.
　　［5］张莉萍,蒋纪恺,谭荣安，等.苦参碱对K562细胞株端粒酶活性和细胞周期的影响［J］.中华肿瘤杂志，1998，20（5）：328-329.
　　［6］范钰,林庚金,钱立平,等.榄香烯乳对胃癌SGC-7901细胞株端粒酶活性及细胞凋亡的影响［J］.复旦学报(医学科学版),2001,28(1):5-8.
　　收稿日期 2007-07-30