麻黄多糖对ＥＡＴ小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响 捐献骨髓后半生废了

　　摘 要：目的：研究麻黄多糖对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)小鼠免疫功能的影响。方法：通过对小鼠足跖皮下、背部皮下、腹部皮下、颈部皮下等部位进行免疫注射佐剂抗原，造成实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)。给药然后采用流式细胞仪检测各组外周血淋巴细胞亚群的水平。结果：麻黄多糖大剂量组脾指数低于模型组，表明麻黄多糖对EAT小鼠脾脏生长有一定的抑制作用；模型组小鼠CD4+淋巴细胞下降，CD8+淋巴细胞上升，与正常组相比，CD4+/CD8+比值显著增加。麻黄多糖33mg/kg与66mg/kg剂量组CD8+淋巴细胞相对含量较模型组显著上升，CD4+淋巴细胞略有下降，其CD4+/CD8+比值显著下降。结论：麻黄多糖治疗实验性自身免疫性甲状腺炎可能与其干预外周血淋巴细胞亚群有一定的关系。
　　关键词：麻黄多糖；实验性自身免疫性甲状腺炎；CD4+/CD8+
　　中图分类号：R285.5
　　文献标识码：A文章编号：
　　1673-7717（2008）05-1069-03
　　
　　Effects of Ephedran on Lymphocyte Subgroups of EAT Mice��
　　YAN Shi�hai, ZHU Xuan�xuan, MEN Da�li, GU He�ya�
　　(Affiliated Hospital of Nanjing University ofChinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangshu, China)�
　　Abstract:Objective:Study the effects of ephedran on lymphocyte subgroups of experimental autoimmune thyroiditis Mice (EAT). Methods:Pure mice thyroid globulin(TG) antigen and Complete Freund"Adjunt (CFA) were mixed by 2mg/mL equally to make the oil-wrap-water emulsion. Female ICR mice were divided random for experiment. The emulsion of TG and CFA were injected into multi-part of the model mice with 0.2mL (each time 100ug TG), once a week and totally 5 times, meanwhile, the mice in control group were injected with physiological saline. The mice in control group were drunken distilled water, while the ones in other groups were given high iodine water (formed by joining 0.64gram kalium iodide into 1litre). Mice were given ephedran. In last the blood were taken and were examined with flow cytometer (FCM). Results:CD4+ lymphoid cells of EAT model mice were higher than control group (P4+/CD8+ were obviously higher (P4+/CD8+ of 66mg/kg dose and 33mg/kg dose enphedran groups were both lower than the model group (P8+ lymphoid cells of 66mg/kg dose and 33mg/kg dose enphedran groups were higher than model group.Conclusion: Enphedran can interfere in lymphocyte subgroups of EAT, which might be relative to the therapeutic effect of enphedran on EAT.
　　Keywords:enphedran; EAT; CD4+/CD8+ �
　　
　　自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis，AT），又称为慢性淋巴细胞性甲状腺炎。1912年由日本桥本策首先报道4个病例的临床表现：甲状腺呈弥漫性淋巴细胞浸润，纤维化，间质萎缩及腺泡细胞的嗜酸性改变。故常又称桥本氏甲状腺炎（Hashimoto’Thyroiditis, HT）。本病是临床常见的自身免疫性甲状腺疾病。其实际发病率约每年0.3~1.5/1000人。男：女为1：15~20。好发于30~50岁女性[1]。可在任何年龄段见到。我国在60年代初期始见于文献报告，近年来发病率有逐渐增多的趋势[2]。自身免疫性甲状腺炎的发病机制中，自身免疫的调节异常，尤其T淋巴细胞亚群数量和功能的异常正被关注和研究。T细胞在表型和功能上是异质性群体，按表型不同可分为CD+�4和CD+�8两大亚群。麻黄在临床上广泛地用于自身免疫性甲状腺炎的治疗，多糖是其有效成分。本文重点考察了麻黄多糖对EAT小鼠T淋巴细胞亚群的影响。�
　　
　　1实验材料�
　　
　　1.1实验动物ICR小鼠，雌性，体重18~22g，由南京青龙山动物繁殖厂提供。�
　　1.2主要试剂甲状腺球蛋白（Porcine Thyroglobulin，PTg）,sigma公司；完全弗氏佐剂，sigma公司，单抗试剂，美国BIOSCIENCE公司生产，深圳晶美生物工程有限公司分装：FITC(fluorescein isothiocyanate)anti-mouse CD4，PE(phycoreythrin) anti-mouse CD8a，PE-CY5 anti-mouse CD3e；盐酸泼尼松片（Prednison Acetate Tablets，PAT），亦称强的松，浙江仙琚制药有限公司；麻黄多糖，由江苏省中医院制剂部提取；甲状腺片，浙江尖峰药业有限公司。�
　　1.3实验仪器流式细胞仪（flow cytometer）型号FACS Calibur，BECTON DICKSON公司。FCM获取细胞数及分析均采用Cellquest软件。�
　　
　　2实验方法�
　　
　　2.1EAT动物模型的建立参考文献方法[3-4] 以2mg/mL纯化小鼠TG抗原（溶于生理盐水）与CFA等剂量混合，充分混合后制成油包水乳剂，对小鼠进行足跖皮下、背部皮下、腹部皮下、颈部皮下等部位进行免疫注射，注射佐剂抗原0.2mL（每次100μgTG），每周1次，共注射5次；正常组注射生理盐水。正常组自由饮蒸馏水，其它各组小鼠饮用高碘水（1L水中加入0.64g碘化钾配制而成）。�
　　2.2给药（1）正常对照组：给予等容量蒸馏水，20mL/kg；（2）模型组：给予等容量蒸馏水，20mL/kg；（3）甲状腺片组13.3mg/kg；（4）强的松组10mg/kg；（5）麻黄多糖小剂量组33mg/kg；（6）麻黄多糖大剂量组66mg/kg。从第2周开始按上述剂量给药，每日给药1次，连续给药4周，20mL/kg。第6周禁食24h后处死小鼠，眼眶静脉取血，眼眶取血后，脱颈椎处死小鼠，取脾与胸腺称重，计算脾指数与胸腺指数。�
　　2.3对EAT小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响小鼠静脉血0.1mL，以枸橼酸钠抗凝。制备单细胞悬液：将1×105～1×107的细胞放入1.5mL离心管中，3000r/min离心5min弃上清，加入缓冲液100μL，悬浮细胞。标记：用50μL单细胞悬液加入上述3种单抗标记，PE-CY5 anti-mouse CD3e滴加2.5μL/管，FITCanti-mouse CD4滴加1μL/管，PE anti-mouse CD8a滴加2μL/管；暗处常温反映30min；自配溶血素溶血10min，3000r/min离心5min弃上清；PBS缓冲液洗涤细胞2次；1%多聚甲醛固定；染色后24h内上机检测。�
　　2.4统计方法实验结果以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS13.0统计软件作t检验与方差分析。�
　　
　　3实验结果�
　　
　　3.1对EAT小鼠脏器系数的影响模型组小鼠胸腺指数小于正常对照组，脾指数大于正常组，但与正常组相比，均没有统计学意义。麻黄多糖组脾指数低于模型组，与模型组相比有显著性差异（P�0.05）。表明麻黄多糖对EAT小鼠脾脏生长有一定的抑制作用，但效果不如强的松明显。麻黄多糖组小鼠胸腺指数有不同程度降低但无统计学意义，强的松对小鼠胸腺具有明显抑制作用，见表1。
　　
　　3.2对EAT小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响模型组小鼠CD+4淋巴细胞下降，CD+ �8淋巴细胞上升，CD+4/CD+ �8比值显著增加。麻黄多糖33mg/kg与66mg/kg剂量组CD+ �8淋巴细胞相对含量较模型组显著上升，CD+4淋巴细胞略有下降，CD+4/CD+ �8比值显著下降。结果见表2、图1。
　　
　　
　　4讨论
　　
　　机体的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可以分成3大类：T淋巴细胞 (CD�3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞参与了抗原特异的细胞介导的免疫反应，并对B淋巴细胞分泌免疫球蛋白的过程进行调控。T细胞在表型和功能上是异质性群体，按表型不同可分为CD+4和CD+8两大亚群；根据不同的功能特性，T淋巴细胞分为辅助性T淋巴细胞(Th)，属CD+4亚群，CD+4辅助T细胞活化Mф、NK细胞，增强它们吞噬或杀伤功能；抑制性T淋巴细胞(Ts)与细胞毒性T淋巴细胞(Tc)属CD+8亚群，CD+8T细胞又称细胞毒性T淋巴细胞（CTL），其主要作用是特异性直接杀伤靶细胞，CTL在杀伤靶细胞的过程中自身不受损伤，可反复杀伤多个靶细胞。T淋巴细胞在人类桥本氏甲状腺炎和EAT小鼠的细胞和体液免疫应答中均有重要地位。正常免疫应答过程有赖于各种免疫细胞，特别是各种T细胞亚群之间的相互协作或相互制约，以形成适度的免疫应答，使之既能清除抗原性异物，又不损伤机体自身组织。在免疫应答过程中TＨ细胞和TS细胞起着十分重要的调节作用。若TＨ功能低下，机体易发生感染；若TＳ细胞功能低下，机体可发生过强的免疫应答，并导致某些免疫性疾病，如自身免疫性疾病，超敏反应等。因此检测CD+4、CD+8及CD+4/CD+8的水平可以表示机体的免疫情况[5-6]。
　　自身免疫性甲状腺炎的发病机制中，自身免疫的调节异常，尤其T淋巴细胞亚群数量和功能的异常[7]正被关注和研究。T淋巴细胞特别是抑制性T淋巴细胞的遗传性缺陷，对B淋巴细胞形成的自身抗体不能正常发挥正常抑制作用，导致甲状腺自身抗体的形成。抗体-抗原复合物沉着于细胞基底膜上，激活K细胞(杀伤细胞)而发挥其细胞毒作用，使甲状腺自体细胞受到破坏。
　　正常时抑制性T细胞在维持自身耐受中起了重要作用：给新生去胸腺或用环孢素处理的小鼠自发甲状腺炎、胃炎、卵巢炎或睾丸炎等器官特异自身免疫病，给这些小鼠补充正常脾脏T细胞(L3T+4和Ly+4T细胞)，则可防止自身免疫病。正常机体内的T淋巴细胞可以防止慢性甲状腺炎患者自身抗原诱导的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的生成，而取自患者的CD+8细胞则无此作用，且不能抑制被激活的多克隆B细胞合成抗体。
　　活化CD+4T细胞所提供的CD+40L(gp39)及其细胞因子，对天然B细胞活化、增殖、分化和免疫球蛋白类的转换以及抑制凋亡等方面都起着重要作用[8]。许多学者指出，患者Ts细胞减少，Ts和Th细胞平衡紊乱，免疫调节失控，可导致针对甲状腺抗原的B细胞和自身特异性抗体的增高[9]。
　　AT的发病机制可能包括：①Thl细胞与Th2细胞平衡失调；②CD+4T细胞与CD+8T细胞平衡失调；③促炎症细胞因子与抗炎性细胞因子的失衡；④细胞凋亡异常，自身反应细胞有中枢性和外周性凋亡。免疫应答的规律是先效应细胞增生，后出现抑制性CD+8T细胞使应答处于平稳和下降阶段，随后多数效应细胞发生凋亡(CD+4T细胞是通过Fas-FasL途径，CD+8T细胞主要是通过TNF-TNF-R途径引起凋亡)，凋亡的分子机制已较清楚。因此凋亡是维持自身稳定的一个重要调节机制。
　　实验表明，模型组小鼠CD+4淋巴细胞相对含量增高，CD+8淋巴细胞相对含量降低，CD+4/CD+8比值明显增大。与文献报道[10]一致。说明EAT小鼠的T淋巴细胞已经处于激活状态，自身免疫应答已经产生。麻黄多糖能降低CD+4T细胞的相对含量，明显降低CD+4与CD+8的比值，使T淋巴细胞CD+4/CD+8恢复到正常范围，而并没有明显降低CD+8淋巴细胞的相对含量，说明麻黄多糖可能通过抑制CD+4淋巴细胞，抑制T淋巴细胞对自身抗原的识别和应答，使对已过激应答的免疫系统得到有效控制，而不是通过降低T淋巴细胞的相对含量来实现对自身免疫损伤的调控。EAT模型组CD+8阳性T细胞数低于正常组，CD+4/CD+8比值明显高于正常组，麻黄多糖治疗的EAT小鼠CD+8阳性T细胞数明显升高，治疗各组CD+4/CD+8比值明显降低，均有显著性差异，这提示EAT小鼠存在T淋巴细胞亚群数量异常和平衡失调，麻黄多糖对此有调整作用。�
　　
　　参考文献�
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