血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂洛沙坦对脓毒症大鼠多脏器的保护作用:血管紧张素受体拮抗剂

　　[摘要]目的 探讨血管紧张素Ⅱ受体（AT1型）特异性拮抗剂洛沙坦（losartan）对脓毒症大鼠心、肝、肾、肺、小肠等多脏器的保护作用及对预后的影响。方法 SD清洁级大鼠120只，雌雄不拘，随机分为4组，即假手术组（30只）、脓毒症组（30只）和脓毒症大鼠30mg/kg剂量的洛沙组在制模前预给药、制模后给药造成处理组（各30只）。采用改良盲肠结扎穿孔方法（CLP）建立大鼠脓毒症模型。观测各组动物心、肝、肾、肺、小肠等脏器功能指标。各组剩15只大鼠计算5d累计死亡率。结果 与假手术组比较，脓毒症组大鼠心、肝、肾、肺、小肠等功能指标有显著变化 （P＜0.05），病理损害较严重，死亡率显著升高（P＜0.05）；与脓毒症组比较，给予洛沙组处理的两组大鼠心、肝、肾、肺、小肠等功能指标与脓毒症组比较显著好转（P＜0.05），病理损害较轻，死亡率显著下降（P＜0.05）。两洛沙坦处理组无明显差异（P＞0.05）。结论 洛沙坦对脓毒症大鼠心、肝、肾、肺、小肠等多脏器具有保护作用，并能改善预后。
　　[关键词] 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂；洛沙坦；脓毒症；盲肠结扎穿孔；多脏器保护
　　[中图分类号] R631 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）23-20-05
　　
　　Angiotensin Ⅱ Receptor Antagonist Losartan on Acute Protective Effect of Multiple Organs in Rat with Sepsis
　　WANG Yao FEI Maoyun FENG Wenming BAO Ying TAO Yulong QIN Lianjin ZHANG Xiaolan JIANG Xiaoying
　　Institute of Molecular Sugery， The First People’s Hospital of Huzhou City in Zhejiang Province， Huzhou 313000， China
　　
　　[Abstract] Objective To study the role of Angiotensin Ⅱreceptor （AT1-type） antagonist losartan in rat with sepsis on acute protective effect of multiple organs including heart，liver，kidney，lung and intestine. Methods One hundred and Twenty SD rats were randomly divided in to sham operated group（SHAM）， septic group（CLP）， losartan pre-CLP group （pre-CLP） and losartan post-CLP group（pre-CLP）.Each group has 30 rats.Sepsis model was produced by cecalligation and puncture（CLP）. To observe the organ function parameters in all groups of heart，liver，kidney，lung and intestine.Remaining 15 rats in each group calculated the 5d cumulative mortality rate.Results Compared with SHAM group，the organ function parameters of CLP group were significantly abnormal（P＜0.05），pathological damage were more severe， the Mortality rate were significantly increased（P＜0.05）. Compared with CLP group， the organ function parameters of the two losartan groups were Significantly improved （P＜0.05），the Mortality rate were significantly decreased（P＜0.05），and had Less pathological damage. There were no significant difference between pre-CLP group and post-CLP group（P＞0.05）. Conclusion Losartan has acute protective effect of multiple organs in rat with sepsis，and can improve the prognosis in sepsis.
　　[Key words] Angiotensin Ⅱ receptor antagonist；Losartan；Sepsis；CLP；Multiple organ protection
　　
　　脓毒症是严重创伤、感染及大手术等应激状况时常见的并发症，已成为目前重症监护病房的首要死亡原因，进一步发展可导致多器官功能障碍综合征（MODS）[1]。脓毒症机体组织及细胞可释放许多炎性介质及细胞因子，这是构成多器官功能损害及衰竭的基本因素，其中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）起了重要作用[2]。血管紧张素Ⅱ受体（AT1型）特异性拮抗剂洛沙坦（losartan）可以阻断AngⅡ的作用环节，本实验用洛沙坦处理脓毒症大鼠，观察其对各脏器功能的保护作用及其对脓毒症大鼠预后的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物及分组
　　清洁级健康SD雄性大鼠120只，体重270～320g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。随机分为4组，即假手术组（SHAM）、脓毒症组（CLP）和洛沙组（30mg/kg）[3]（购自美国Cayman公司）在制模前和制模后给药造成处理组（Pre-CLP和Post-CLP），各组30只。
　　1.2 脓毒症模型建立
　　采用盲肠结扎穿孔方法建立大鼠脓毒症模型。参照Wichterman 等[4]的改良盲肠结扎穿孔（CLP） 方法，将盲肠穿孔数由2个增至4个，SHAM组除不施行CLP，其余操作同CLP组。
　　1.3 心功能检测指标
　　各组随机抽取5只大鼠经右颈总动脉插管至左心室，连接Pclab -3802型生物医学信号采集系统，观测制模后6h大鼠平均动脉血压（MAP）和左心室收缩压（LVSP）以及心室压力最大变化速率（±dP/dtmax）。并于制模后6h抽取大鼠静脉血，采用罗氏2010电化学发光免疫分析仪测定心肌肌钙蛋白T（cTnT），采用美国贝克曼Beckman 公司生产的CX5全自动生化分析仪， 定量检测肌酸激酶同工酶MB（CK-MB），试剂盒也由美国贝克曼公司提供。6h后断头处死大鼠，取左室心肌组织，常规石蜡切片，在光镜下观察并照相。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1.4 肺功能检测指标
　　各组再随机抽取5只大鼠，制模后5.5h按30mg/kg经大鼠尾静脉注射2%伊文思蓝液（EBD，北京恒业中远化工有限公司）。①伊文思蓝含量测定法[5]：制模后6h将动物麻醉开胸取部分左肺，剪去周围组织，吸干表面水分及血液，称量湿质量，将肺组织剪成约10mm3小块浸泡于甲酰胺溶液中（0.2g/kg） ，置60℃恒温水浴中抽提24h，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，在与标准曲线相同的条件下，用紫外分光光度计（岛津2000）在620nm波长处进行比色测定光密度值，在标准曲线上查出EB含量，以每克肺组织干重含EB质量表示。②湿/干质量比测定：称肺组织湿质量后置烤箱80℃，72h，称干质量，计算湿/干质量比值。为避免EBD影响肺病理切片，将检测心功能用的各大鼠处死后取左肺组织，常规石蜡切片，在光镜下观察并照相。
　　1.5 肾功能、肝功能及小肠功能检测指标
　　各组再抽取5只大鼠，于制模后6h将动物麻醉后活杀，腹主动脉无菌采血，采用美国贝克曼Beckman 公司生产的CX5全自动生化分析仪， 定量检测血Bun、Cr、Na+及尿Cr、Na+并计算滤过钠排泄分数FENa[（尿Na+（mol/L）/血清Na+（mol/L）]/[（尿Cr（mmol/L）/血清Cr（mmol/L）]×100%[6]，反映肾功能，同时检测血ALT、AST、TBIL反映肝功能。各大鼠留取0.5mL血液，并距回盲瓣5cm取回肠组织5cm，采用黎君友等报道的方法测定二胺氧化酶（DAO）含量，并以微量考马斯亮蓝法测定小肠组织蛋白含量，使小肠组织DAO活性以每克蛋白中的量来表示[7]。同时各取肾、肝及末段回肠组织常规石蜡切片，在光镜下观察并照相。
　　1.6 大鼠5d死亡率的计算
　　各组剩下15只大鼠，分别记录各实验动物手术后的自然死亡时间，观察期共5d，计算5d累计死亡率。
　　1.7 统计学处理
　　采用SPSS10.0软件进行处理，计量资料均数（χ±s）表示，组间比较用方差分析，组间两两比较采用q检验，计数资料进行 χ2 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 心功能指标
　　CLP组MAP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/-dtmax指标及cTnT、CK-MB指标与SHAM组比较均有显著差异（P＜0.05）；Pre-CLP组及Post-CLP的MAP、LVSP指标较SHAM组比较显著下降（P＜0.05），较CLP组显著升高（P＜0.05）；两组cTnT、CK-MB指标较SHAM组显著升高（P＜0.05），较CLP组显著下降（P＜0.05）；两组的+dP/dtmax、-dP/-dtmax指标与SHAM组比较无显著性差异（P＞0.05），较CLP组显著升高（P＜0.05）。两处理组之间各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。
　　2.2 肺功能指标
　　 CLP组的肺湿/干比重及肺微血管通透性较SHAM组有显著差异（P＜0.05）；Pre-CLP组及Post-CLP组的肺微血管通透性分别为（0.028±0.006）mg/g、（0.027±0.007）mg/g，与SHAM组比较显著下降（P＜0.05），与CLP组比较显著升高（P＜0.05），两组之间无显著差异（P＞0.05）。Pre-CLP组及Post-CLP组肺湿/干比重与SHAM组比较无显著性差异（P＞0.05），与CLP组比较显著减少（P＜0.05）。两处理组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。
　　2.3 肾功能指标
　　SHAM组、CLP组、Pre-CLP组及Post-CLP组大鼠血Cr浓度、血Na+浓度及尿Cr浓度比较无显著差异（P＞0.05）。CLP组血Bun浓度、尿Na+及滤过钠排泄分数FENa较SHAM组有显著差异（P＜0.05）。Pre-CLP组及Post-CLP组的血BUN浓度较CLP组均显著下降（P＜0.05），与SHAM组无显著差异（P＞0.05）。Pre-CLP组及Post-CLP组尿Na+浓度及滤过钠排泄分数FENa较CLP组显著升高（P＜0.05），较SHAM组显著下降（P＜0.05）。两处理组之间各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。
　　2.4 肝功能指标
　　 CLP组ALT、AST及TBIL指标分别为（128.20±20.75）IU/L、（210.60±38.22）IU/L、（6.34±1.54）μmol/L，较SHAM组均显著升高（P＜0.05），模型成功。Pre-CLP组及Post-CLP组的三项指标较SHAM组无显著差异，但较CLP组有显著下降（P＜0.05）。两处理组之间三项指标差异无显著意义（P＞0.05）。 见表4。
　　2.5 小肠功能指标
　　 CLP组血DAO活性为（1.79±0.37）KU/L，较SHAM组显著升高（P＜0.05），CLP组小肠组织DAO活性为（2.30±0.48）U/g，较SHAM组显著下降（P＜0.05）。Pre-CLP组及Post-CLP组的血DAO及活性小肠组织DAO与SHAM组无显著差异（P＞0.05），但较CLP组有显著差异（P＜0.05）。两处理组之间差异无显著性（P＞0.05）。 见表5。
　　2.6 死亡率
　　两处理组Pre-CLP组和Post-CLP组的死亡率分别46.7%及40.0％，较CLP组均有明显下降（P＜0.05），两组之间无显著差异（P＞0.05）。见表6。
　　2.7 各组心、肝、肾、肺、小肠组织的病理变化（图1）
　　①光镜下SHAM组心肌细胞结构正常，心肌纤维束排列整齐，横纹清晰，心肌间质无水肿；CLP组大鼠心肌纤维部分断裂、溶解，心肌间质明显水肿，炎症细胞浸润；模前及模后洛沙坦组可见心肌纤维结构完整，间质无明显水肿，偶见炎症细胞浸润。②光镜下SHAM组肺组织形态正常，CLP组和洛沙坦组均有不同程度的肺水肿、白细胞浸润、出血和肺不张， CLP组较洛沙坦组肺水肿、白细胞浸润、出血和肺不张更显著。③光镜下SHAM组肾脏未发现组织病理性损伤。CLP组多数动物出现病理性损伤，轻者个别动物可见局灶性肾小管上皮损伤，肾小管内颗粒管型，严重者肾组织可见大量炎性细胞浸润，肾血管广泛微血栓形成和肾小球毛细血管淤血，肾小管上皮细胞水肿、脱落，有大量颗粒管型。两洛沙坦组炎性细胞浸润减轻，肾血管未见明显微血栓形成和肾小球毛细血管淤血，肾小管呈灶状损害，上皮细胞水肿、脱落，偶见颗粒管型。④光镜下SHAM组肝小叶结构完整，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，窦内皮细胞、枯否细胞均未见明显变化。汇管区小叶间动静脉、小叶间胆管结构清晰，未见炎细胞。CLP组可见肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝小叶结构紊乱，窦腔内可见炎细胞聚集，门脉区有较多炎细胞浸润，甚至有亚大块及大块坏死。两洛沙坦组肝组织损害较对照组轻。⑤光镜下SHAM组小肠组织见小肠绒毛有较多嗜酸性白细胞，有少量淋巴细胞浸润，小肠绒毛少许出血；CLP组小肠绒毛增粗、出血明显，大量嗜酸性白细胞、淋巴细胞浸润。两洛沙坦组小肠绒毛增粗、出血较CLP组轻，嗜酸性白细胞、淋巴细胞浸润较CLP组少。
　　3 讨论
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　大鼠CLP模型是目前公认的临床相关性较强的脓毒症模型 [8]。血管紧张素原在循环或局部肾素作用下形成血管紧张素Ⅰ（AngI），AngⅠ可被血管紧张素转化酶（ACE）在内皮细胞内转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），AngⅡ是肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要介质，AngⅡ参与并调节炎症反应，AngⅡ可部分逆转内毒素对G蛋白藕联受体的损伤效应；随着脓毒症的发展，循环及局部RAS的高度激活，AngⅡ水平升高，则对组织或器官功能紊乱的过程起维持和加重作用；AngⅡ本身作为炎性介质还可以诱导炎症反应。脓毒症机体组织及细胞可释放许多炎性介质及细胞因子，这是构成多器官功能损害及衰竭的基本因素，AngⅡ起了重要作用[9]。
　　脓毒症心肌局部RAS激活，心肌局部AngⅡ释放增加可能是脓毒症后心功能障碍的重要因素之一，其机制可能与心肌RAS诱发和加重心肌缺血-再灌注损伤有关。因此使用洛沙坦来拮抗AngⅡ的受体，使其不能发挥作用，脓毒症后心肌损伤具有明显的保护作用。MAP、LVSP及+dP/dtmax 是反映心肌收缩功能的敏感指标，而-dP/dtmax 则是反映心肌舒张功能的敏感指标。在本实验中脓毒症组出现MAP、LVSP、+dP/dtmax下降，提示脓毒症状态存在心肌收缩功能下降，这与Vincent 研究证实脓毒症状态下的心功能衰竭与心肌收缩抑制相关[10]是一致的，处理组MAP、LVSP指标较脓毒症组均有明显升高，表明洛沙坦对心肌脓毒症大鼠心肌具有保护作用。cTnT是迄今为止被认为是一种诊断心肌细胞损伤具有高度敏感性和特异性的指标[11]。本实验观察到对脓毒症组的cTnT 6h处较洛沙坦处理组明显增高，表明洛沙坦能明显减轻脓毒症大鼠心肌细胞损伤。CK-MB变化和cTnT相一致，进一步证实了洛沙坦的心肌保护作用。
　　急性肺水肿是多器官功能障碍综合征在肺部的表现，其本质是直接或间接损伤肺毛细血管内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍及肺毛细血管通透性增高的血管渗漏综合征。目前已知AngⅡ可通过多种机制影响肺损伤过程，如对肺泡上皮的促凋亡作用，介导肺动脉高压和纤维化反应等[12]。本实验洛沙坦处理组肺组织湿/干重比、肺微血管通透性和组织形态学变化均较CLP组显著好转，提示应用洛沙坦可减轻肺水肿，改善肺微血管通透性，对肺具有保护作用。
　　脓毒症并发急性肾功能衰竭（ARF）的发病机制尚不清楚，细胞因子、低血压或肾脏灌注不足都可能是其发病环节。RAS参与了肾功能损害的发生和发展。实验和临床观察提示，RAS在急性肾功能衰竭（ARF）中起着重要的作用，是维持肾血管收缩的因素，其促进肾缺血，最终导致ARF。纠正肾脏局部RAS的紊乱对于减轻肾脏损伤具有重要意义，可以避免脓毒症时器官损伤的发生[6]。本实验中洛沙坦处理组的肾功能指标血BUN、滤过钠排泄分数及组织形态学变化均较CLP组有明显的改善，提示洛沙坦对肾具有保护作用。但血Cr、血Na+等指标无显著差异，可能与肾功能的代偿能力较强，6h尚属早期有关。
　　AngⅡ在脓毒血症引起的肝缺血、缺氧和缺血-再灌注损伤中发挥着关键作用[13]。本实验中CLP大鼠ALT、AST及TBIL升高较明显，肝组织病理损害清晰，洛沙坦处理组有明显改善，提示洛沙坦对肝功能亦有明显的保护作用。
　　小肠是脓毒症时最易受损的器官之一，其在脓毒症的发生、发展过程中有着重要的作用。脓毒症时可伴发肠黏膜屏障功能不全、肠渗透性增高，Tadros进行实验观察发现AngⅡ在脓毒症所引起肠缺血-再灌注损害中有重要作用[14]。DAO存在于哺乳动物的黏膜或绒毛上层，其中大部分存在于小肠黏膜绒毛。它是具有高度活性的细胞内酶，是反映小肠黏膜结构和功能较为理想的指标[15]。在本实验中，脓毒症时血中DAO含量升高，而小肠DAO活性下降，考虑可能是坏死肠黏膜细胞脱落进入肠腔，使小肠组织DAO含量降低。上述结果均提示小肠黏膜屏障功能损伤，洛沙坦处理组则这种变化不明显，提示洛沙坦对小肠功能有保护作用。两洛沙坦处理组大鼠的5d累计死亡率均较CLP有显著降低，提示洛沙坦可改善脓毒症大鼠的预后。
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　　（收稿日期：2011-05-11）
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