意见-中国病原生物学杂志

　 血清蛋白质HP、TIMP-1和PEPD与肺结核病理的关联性研究*

　尉理梁1、王建华1、张秀军1、陶学芳1、吴玲芳1、吕秋琼1、

　张宏梅2、冯宪敏2*

　（1绍兴市第六人民医院呼吸科，绍兴 312000; 2吉林医药学院病原生物学教研室，吉林 132013）

　血清蛋白质HP、TIMP-1和PEPD与肺结核病理的关联性研究

　尉理梁1、王建华1、张秀军1、陶学芳1、吴玲芳1、吕秋琼1、张宏梅2、冯宪敏2*

　（1绍兴市第六人民医院呼吸科，绍兴 312000; 2吉林医药学院病原生物学教研室，吉林 132013）

　并通过单/双肺分组，揭示其与疾病严重程度的相关性，阐明其在病理改变中所起的作用本研究分析了94例肺结核病患者和41例正常对照的临床资料，采用ELISA法结核病患者和正常对照组的触珠蛋白（haptoglobin，HP）、基质蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1）和脯氨酸肽酶（prolidase，PEPD）进行检测发现肺结核病患者血清HP、PEPD显著高于正常对照组（P=0.009，P=0.035）；双肺损害组TIMP-1、PEPD显著高于单肺损害组（P=0.041，P=0.003）。本研究表明，肺结核病患者血清HP、TIMP-1、PEPD蛋白与肺结核病发病、病理改变存在关联，血清蛋白质水平可以反应肺结核病的严重程度。

　[关键词] 血清；肺结核病；HP；TIMP-1；PEPD

　Association analysis between serum protein levels and the severity of tuberculosis

　WEI Li-liang1, ZHANG Xiu-jun1, WANG Jian-hua1, TAO Xue-fang1, WU Ling-fang1, LV QIU-qiong1，ZHANG Hong-mei2, FENG Xian-min2*

　（1The Sixth Hospital of Shaoxing，Zhejiang Shaoxing 312000; 2Jilin Medical College, Jilin 132013, China）

　[Abstract] Mycobacterium tuberculosis infection can activate the innate immune system; disorder the levels of acute phase protein, extracellular matrix proteins, and proteolytic enzyme; leading to pathological changes such as inflammatory granuloma, caseous necrosis and cavity formation. To explore the relationship between the incidence of TB and serum proteins by clinical data analysis and serum protein detection. And to reveal the correlation between disease severity and serum proteins by single and double-lung injury grouping. Methods Clinical data of 94 cases of tuberculosis (TB) and 41 cases of healthy controls were analyzed using statistical methods, showing significant difference in serum albumin, globulin, acute phase proteins, and lipid metabolism related proteins (P<0.01). And serum levels of haptoglobin (HP), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), and prolidase (PEPD) were detected using the ELISA method among the controls, single-lung injury TB, and double-lung injury TB groups. Results It is found that significantly higher levels of serum HP and PEPD (P=0.009, P=0.035) in TB group, and significantly higher levels of TIMP-1 and PEPD (P=0.041, P=0.003) in double-lung injury TB group. Conclusion It is showed that HP, TIMP-1, and PEPD may indicate pathogenesis and pathological changes of TB, and serum protein levels can react the severity of TB.

　[Key words] serum; tuberculosis; haptoglobin; tissue inhibitor of metalloproteinases-1; prolidase

　 肺结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）入侵引起的疾病。据WHO报道，2012年全球新发TB860万例，死亡130万例，我国发病人数约占全球发病人数的12%，死亡人数约为4.4万[1]。中国第五次结核病流行病学调查显示，15岁及以上活动性TB患者高达499万 [2]。肺结核病仍是中国传染性疾病的重要防治对象。MTB感染人体会出现许多病理改变，如炎性渗出、肉芽肿、干酪样坏死、空洞等，这些病理改变的分子机制仍未明确。有文献报道，MTB感染人体后，固有免疫系统激活，SAA、CRP等急性反应蛋白增高[3,4]，金属基质蛋白酶9（MMP-9）[5]、蛋白水解酶[6]紊乱。因此，我们推测TB患者急性反应期蛋白（触珠蛋白，HP）、基质蛋白酶抑制剂（基质蛋白酶抑制剂-1，TIMP-1）、蛋白水解酶（脯氨酸肽酶，PEPD）水平与TB患者病理改变相关。本研究通过检测TB患者血清HP、TIMP-1、PEPD水平，并通过单/双肺分组，揭示其与TB发病、疾病严重程度的相关性，阐明其在TB病理改变中所起的作用。

　材料和方法

　人HP试剂盒购自艾美捷科技有限公司（Abcam，MA，USA），人TIMP-1试剂盒购自亚诺法生技股份有限公司(Abnova?Co.，Taipei，Taiwan)，人PEPD试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司（Cusabio Biotech. Co.，LTD，China）。主要仪器包括离心机（Thermo公司），紫外分光光度计（美国bio-rad 680）等。

　在94例肺结核病患者中，38名为女性(40.43%)，56名为男性(59.57%)，平均年龄为40.39±15.28岁，样本均来自绍兴市第六医院。按单/双肺损害分组后，单肺损害组48例，双肺损害组46例，组间年龄、性别分布无显著差异。正常对照组为41例无偿献血者血样，其中16名女性(39.02%)，25名男性(60.98%)，平均年龄为40.61±10.19岁，均排除TB感染病史和自体免疫疾病史（表1.）。

　本研究绍兴市第六医院伦理委员会批准，并与研究对象在实验前签订了知情同意书。

　表 1. 肺结核病组和正常对照组的基本资料

　Table 1 Basic information of the TB group and control group

　 肺结核病组 (N = 94) 正常对照组 (N= 41) P 年龄 （mean ± SD）

　性别：女性，No.（%）

　体重指数（mean ± SD）

　痰菌涂片阳性，No.（%）

　吸烟史，No.（%）

　卡介苗接种史，No.（%） 18-67 (40.39±15.28)

　38 (40.43)

　21.33 ± 4.25

　53 (56.38)

　33 (35.11)

　84 (89.36) 23-58 (40.61±10.19)

　16(39.02)

　24.86± 5.66

　 /

　10(24.39)

　38(92.68) 0.93

　0.88

　0.32

　/

　0.22

　0.55 2.2. 血清样本采集

　所有受检者均于晨8～9时空腹（肺结核病患者用药前血清样本分装并保存于-80℃冰箱。

　白蛋白、球蛋白、急性反应期蛋白、脂代谢相关蛋白等HP、TIMP-1、PEPD蛋白按照1：2000，1：100 000，1：10稀释，并按照说明书HP、TIMP-1PEPD蛋白。

　统计分析

　采用SPSS 16.0软件行统计学处理，数据用平均数 ± 标准差（mean ± SD）表示，P＜0.05记做有统计学差异。两组数据构成比比较采用卡方检验、均数比较采用t检验；多组数据比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。

　结 果

　我们对94例肺结核病组和41例正常对照组的临床资料进行分析，发现肺结核病患者与正常对照存在多种显著性差异蛋白，包括白蛋白、球蛋白、急性反应期蛋白、脂代谢相关蛋白等（表2）。

　表 2. 肺结核病组和正常对照组的临床资料

　Table 2 Clinical data of the TB group and control group

　 肺结核病组（N=94） 正常对照组（N=41） P Total protein (g/L) 67.78 ± 6.64 72.88 ± 2.02 < 0.001** 白蛋白

　Albumin (g/L) 37.68 ± 4.76 44.23 ± 2.23 < 0.001** 球蛋白

　Globulin (g/L) 30.00 ± 5.84 25.77 ± 2.69 < 0.001** 白蛋白/球蛋白

　A/G 1.30 ± 0.32 1.81 ± 0.21 < 0.001** C反应蛋白

　CRP (mg/L) 32.31 ± 43.83 0.82 ± 1.51 < 0.001** 前白蛋白

　Prealbumin (g/L) 0.18 ± 0.07 0.22 ± 0.06 < 0.001** 甘油三酯

　Triglyceride (mmol/L) 1.07 ± 0.75 1.45 ± 1.24 0.004** 高密度脂蛋白-C

　HDL-C (mmol/L) 1.00 ± 0.34 1.22 ± 0.32 < 0.001** 低密度脂蛋白-C

　LDL-C (mmol/L) 2.26 ± 0.85 2.82 ± 0.77 < 0.001** 脂蛋白

　Lipoprotein (mg/L) 267.45 ± 270.08 182.86 ± 111.82 0.006** 免疫球蛋白G

　IgG (g/L) 14.20 ± 4.07 12.58 ± 2.28 0.002** 免疫球蛋白A

　IgA (g/L) 2.95 ± 1.31 2.14 ± 0.86 < 0.001** 免疫球蛋白M

　IgM (g/L) 1.23 ± 0.59 1.00 ± 0.54 0.007** ** P < 0.01.

　2.ELISA检测结果 ELISA结果比较发现，肺结核病患者组血清HP、PEPD显著高于正常对照组（P=0.009， P=0.035），TIMP-1水平无显著差异（P＞0.05）（图1）。

　肺结核病患者经过单/双肺损害分组后与正常对照组对比可见，血清HP在三组中分布存在显著差异（P=0.030），单肺损害组（P=0.029）双肺损害组（P=0.017）正常对照组P＞0.05。血清TIMP-1含量（P=0.029），双肺损害组（P=0.041）。三组间血清PEPD水平也不相同（P＜0.001），双肺损害组单肺损害组（P=0.003）（图2）。

　图 1 正常对照组和肺结核病组血清HP、TIMP-1、PEPD水平

　A：HP；B：TIMP-1；C：PEPD。* P < 0.05; ** P < 0.01.

　Fig. 1 Serum HP, TIMP-1, PEPD level of TB group and control group

　A: HP; B: TIMP-1; C: PEPD. * P < 0.05; ** P < 0.01.

　图 2 正常对照组和肺结核病单/双肺损害组血清HP、TIMP-1、PEPD水平

　A：HP；B：TIMP-1；C：PEPD。* P < 0.05; ** P < 0.01.

　Fig. 2 Serum HP, TIMP-1, PEPD level of single-lung injury TB/ double-lung injury TB groups and control group.

　A: HP; B: TIMP-1; C: PEPD. * P < 0.05; ** P < 0.01.

　讨论HP也是一种急性反应蛋白，能结合并消除血红蛋白，阻止血液中氧自由基的产生，减小血红蛋白引起的毒性作用[7, 8]。有研究表明被MTB感染的巨噬细胞、肉芽肿等均处于低氧状态[9, 10]。肺结核病患者血清HP表达较正常对照组高（P=0.009），可能是由于机体受MTB感染处于低氧状态时，血红蛋白含量增加，为了保护机体免受血红蛋白引起的毒性作用，HP含量随之增加。

　肺结核病肉芽肿基质中含有大量胶原蛋白、透明质酸。基质金属蛋白酶可以水解基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶，已有研究发现肺结核病人群MMP-9增高[11]，且MMP-9在有肉芽肿的患者中较无肉芽肿患者高[12]。TIMP-1可抑制MMP-9的活性。本研究发现双肺损害组TIMP-1水平显著高于单肺损害组（P=0.041），可能是由于双肺损害组较单肺损害组存在更多的肉芽肿组织。

　肉芽肿的干酪样坏死、液化是由于宿主蛋白水解酶紊乱，导致胶原降解、组织破坏。PEPD是蛋白水解酶的一种，可以水解肽段羧基端的脯氨酸或羟脯氨酸。White MJ [13]发现，PEPD在调节结核分枝杆菌细胞质外应激反应途径中有重要作用。Gumus S [14]则通过组织降解增加、纤维母细胞活性增加、免疫球蛋白及补体系统C1q成分增加来解释肺结核病组与正常对照组的PEPD活性差异。而另有文献报道C1q在肺结核病组和正常对照组中无显著性差异[15]。因此，我们推测，本实验中肺结核病组PEPD显著高于正常对照组（P=0.035），可能是由于肺结核病患者免疫球蛋白增加，肉芽肿形成，组织降解增加所致。且双肺损害组显著高于单肺损害组（P=0.003），可能是由于双肺损害组较单肺损害组疾病严重程度更甚，因此PEPD增高更多。

　本研究发现肺结核病患者血清HP、PEPD升高，且TIMP-1、PEPD在单/双肺损害分组间存在显著差异。HP、TIMP-1、PEPD在肺结核病发病和病理改变中发挥了重要的作用，TIMP-1和PEPD水平可以反应肺结核病的严重程度。

　[Internet] World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2013. /tb/publications/global_report/en/index.html.

　Technical Guidance Group of the Fifth National TB Epidemiological Survey, The Office of the Fifth National TB Epidemiological Survey. The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010. Chin J Antituber. 2012, 34(8):485-508.

　Means TK, Wang S, Lien E, et al. Human toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis [J]. J Immunol. 1999, 163(7): 3920-7.

　Phalane KG, Kriel M, Loxton AG, et al. Differential expression of host biomarkers in saliva and serum samples from individuals with suspected pulmonary tuberculosis [J]. Mediators Inflamm. 2013, 2013:981984.

　Taylor JL, Hattle JM, Dreitz SA, et al. Role for matrix metalloproteinase 9 in granuloma formation during pulmonary Mycobacterium tuberculosis infection [J]. Infect Immun. 2006, 74(11):6135-44.

　Kumar V, Abbas AK, Fausto N, et al. Robbins and Cotran Pathologic basis of disease, 7th edn. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders, 2005:22.

　Froguel P, Ndiaye NC, Bonnefond A，etal. A Genome-Wide Association Study Identifies rs2000999 as a Strong Genetic Determinant of Circulating Haptoglobin Levels [J]. PLOS ONE, 2012, 7(3): e32327.

　Tsai MC, Chakravarty S, Zhu G, et al. Characterization of the tuberculous granuloma in murine and human lungs: cellular composition and relative tissue oxygen tension [J]. Cell Microbiol. 2006, 8: 218–32.

　Nickel D, Busch M, Mayer D,etal. Hypoxia Triggers the Expression of Human β Defensin 2 and Antimicrobial Activity against Mycobacterium tuberculosis in Human Macrophages, the journal of immunology [J]. 2012, 188:4001-7.

　Lange C, Sester M. TB or not TB: the role of immunodiagnosis [J]. Eur J Immunol. 2012, 42(11):2840-3.

　Hsieh WY, Kuan TC, Cheng KS, et al. ACE/ACE2 ratio and MMP-9 activity as potential biomarkers in tuberculous pleural effusions [J]. Int J Biol Sci. 2012;8(8):1197-205.

　Sheen P, O’Kane CM, Chaudhary K, et al. High MMP-9 activity characterises pleural tuberculosis correlating with granuloma formation [J]. Eur. Respir. J. 2009, 33, 134-41.

　White MJ, Savaryn JP, Bretl DJ, et al. The HtrA-like serine protease PepD interacts with and modulates the Mycobacterium tuberculosis 35-kDa antigen outer envelope protein [J]. PLoS One. 2011, 6(3):e18175.

　Gumus S, Yaman H, Ozcan O, et al. Serum prolidase activity in patients with pulmonary tuberculosis [J]. Scand J Clin Lab Invest. 2011; 71(6):467-72.

　Xu DD, Deng DF, Li X, et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS [J]. Proteomics, 2014;14(2-3):322-31.

　* 【基金项目】本浙江省医药卫生一般研究计划No.2013KYA209），吉林省教育厅课题No.2014367）。

　* * 冯宪敏Email: fengxianmin28@163.com

　 【作者简介】尉理梁（1981—），男（汉族），浙江绍兴，本科，主治医师。Email: weililiang1981@163.com