防己黄芪汤防治肾间质纤维化的实验研究|肾间质纤维化

　　摘 要：目的：了解防己黄芪汤对肾间质纤维化的作用，以及去除甘草后对其作用的影响。方法：采用大鼠单侧输尿管结扎（UUO)模型，用防己黄芪汤以及防己黄芪去甘草汤干预，观察肾功能水平、肾病理以及肾α-平滑肌蛋白（α-SMA）和纤维连接蛋白（FN）蛋白和基因表达。结果：防己黄芪汤可降低UUO大鼠血尿素氮，使血白蛋白升高；减轻肾小管间质纤维化程度；同时，显著降低肾小管和肾间质α-SMA、FN的蛋白和基因表达。去甘草汤组与防己黄芪汤一样，改善了肾间质纤维化的多项指标，而且从数据来看，有进一步下降血尿素氮、以及FN表达的趋势。结论：防己黄芪汤具有抑制肾纤维化、改善肾功能的作用。组方去除甘草后没有影响这一作用，甚至有可能更好。
　　关键词：肾间质纤维化；平滑肌肌动蛋白；纤维连接蛋白；防己黄芪汤中图分类号：R285.5文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)05-1000-03
　　
　　Experimental Study of Fangji Huangqi Tang to Renal Interstitial Fibrosis
　　YU Dong�rong�1,YANG Ru�chun�1,WANG Jun�1,LI Jian�qiu�2,WANG Yong�jun�1
　　(1.Guangxiang Hospital Affiliated Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310007,Zhejiang,China;
　　2.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)
　　Abstract:Objective:Fangji Huangqi Tang is Chinese traditional medicine,used in renal diseases for thousands years. It has not studied whether it influence renal interstitial fibrosis. It include Fangji,Huangqi,Baishu,Gancao,Fangji and Huangqi,which can improve renal interstitial fibrosis,while Gancao is not reasonable in renal disease,because of increaseing edema and declining renal damage which caused by Guanmutong. It needs to be proved if Fangji Huangqi Tang can prevent the renal interstitial fibrosis,and the medicine of Fangji Huangqi Tang without Gancao has the same effect.Methods:Rats were given UUO to make the model of renal interstition fibrosis. The rats were treated by Fangji Huangqi Tang,and the medicine of Fangji Huangqi Tang without Gancao. Monopril were regrded as control. 14 days later,the kidney samples of UUO were stained in HE and Masson. The expression of protein and mRNA of α-smooth muscle actin(α-SMA) and Fibronectin(Fn) were examined by immunohistochemical stain and by RT-PCR. Results:Fangji Huangqi Tang can reduce plasma urea nitrogen and increase plasma albumin of the rats of UUO significantly,meanwhile in improve the injury of the renal interstition significantly. The expression of both α-SMA and Fn decrease significantly treated by Fangji Huangqi Tang. Fangji Huangqi Tang without Galcao can also reduce the injury of the renal interstition and expression of protain and mRNA of α-SMA and Fn,moreover it seems that it could have better effect in renal interstition fibrosis．Conclusion：Fangji Huangqi Tang can prevent the renal interstitial fibrosis.Fangji Huangqi Tang without Gancao has the same effect，maybe it improve renal interstitiov fibrosis significantly compared with Fangji Huangqi Tang．Keywords:renal interstitial fibrosis;α-smooth muscle actin;Fibronectin;Fangji Huangqi Tang
　　
　　中药在肾间质纤维化方面作用以往研究多集中在单味中药及其有效成分，或自拟方的研究，缺乏对广泛使用于肾病临床经典方的研究。防己黄芪汤来源于《金匮要略》，具益气除湿之功效，是治疗“风水”、“皮水”、“肾风”的代表方剂，其主药汉防己、黄芪已被发现有抗肾纤维化作用[1-2]，但甘草有“助湿”、“中满忌甘”特性，研究发现可加重关木通肾损害[3]，本课题采用单侧输尿管结扎(UUO)致肾间质纤维化大鼠模型，观察防己黄芪汤对肾间质纤维化的影响，以及去除甘草后对其作用的影响。为临床肾间质纤维化的防治提供新的思路和理论依据。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 实验动物 清洁级SD大鼠(浙江中医药大学动物房提供)56只，雄性，体重（200±3）g。
　　1.2 药物与试剂 中药汉防己、黄芪、白术、甘草购自浙江中医药大学中药饮片厂；蒙诺片由中美施贵宝制药有限公司出品。免疫组化试剂：小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth actin,α-SMA)单克隆抗体，抗鼠纤维连接蛋白(Fn)单克隆抗体，均购自武汉博士德生物技术公司。RNA提取试剂及RT-PCR试剂、Trizol试剂盒购自上海生物工程有限公司。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1.3 实验模型制作 参照文献报道方法，将大鼠固定于手术台上，左侧腹部切开，分离左侧输尿管，丝线结扎两处，并在两处结扎点间剪断输尿管，制作UUO模型。假手术组仅开腹并游离左侧输尿管，但不结扎和剪断。
　　1．4 实验分组 大鼠随机分5组，每组8只，将假手术组作为正常对照，单侧输尿管结扎大鼠随机分为模型组、防己黄芪汤组、防己黄芪去甘草汤组(简称去甘草汤组）、蒙诺对照组。
　　1．5 给药方法 按《方剂学》中记录剂量按大鼠体表面积计算给药，即每天剂量为汉防己0．228g、黄芪0．285g、白术0．171g、甘草0．114g，去甘草汤组是在上述基础上去甘草，对照组给予蒙诺0．19mg(成人剂量10mg/天按大鼠体表面积计算)。煎成2mL汤药或溶解成2mL灌胃，假手术组和模型组以等量生理盐水灌胃。术前1天开始给药。
　　1．6 标本采集 术后14天将各组大鼠处死，股动脉取血，离心分离血清，用作生化检测；取术侧肾组织一半置于10％福尔马林固定液中，作病理切片和免疫组化实验，另一半置于液氮中冷冻保存，以备作RT-PCR检测。
　　1．7 肾组织病理观察 将10％福尔马林固定的肾组织常规石蜡包埋切片，经HE、Masson染色后，采用北京航天大学医学图像采集及分析系统，光镜下观察并采集MASSON染色肾脏病理图像，蓝色为纤维化阳性染色区。每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾小管间质纤维化阳性染色的相对面积，取平均值。
　　1．8 免疫组化 采用SABC法，2％牛血清白蛋白代替一抗作为阴性对照。光镜下采集免疫组化图像，棕黄色为阳性染色，每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾间质阳性染色总面积，取平均值。
　　1．9 RT-PCR 检测Trizol法提取总RNA，两步法进行逆转录和聚合酶链扩增反应(RT-PCR),β-action作为内参照，引物序列见表1。PCR反应条件为：95℃ 5min,95℃30s，50～60℃ 30s，72℃30s，共35循环，72℃ 10min。扩增产物经1．7％琼脂糖凝胶电泳后，BIO-RAD紫外凝胶成像系统成像，用quanity one软件对特异性条带进行半定量分析，结果以目的条带与内参照β-action条带的积分光密度之比值表示。
　　1．10 统计 各组数据用平均数±标准差(±s)表示，应用spss11．0软件对数据进行统计分析，多组间比较方差齐者采用one -way ANOVA法，组间两两比较用LSD法。
　　
　　2 结 果
　　
　　2．1 血尿素氨 肌酐 白蛋白检测 模型组大鼠血尿素氮较假手术组显著升高，药物干预后，防己黄芪汤组、去甘草组血尿素氮水平显著降低，其中去甘草组下降更明显(P≤0．01)，与蒙诺组比较亦有显著差异(P≤0．05)。各组血肌酐比较无显著性差异。模型组大鼠血浆白蛋白下降，药物干预后，防己黄芪汤组及去甘草组血浆白蛋白上升(P≤0．05～0．01)，蒙诺组无明显变化。见表2。
　　表2 各组大鼠血肌酐 血尿素氮及
　　血浆白蛋白韵检测(±s)
　　2.2 肾组织病理形态学 模型组大鼠肾小管明显扩张，上皮细胞肿胀、空泡变性，较多坏死、脱落，甚至小管结构消失，灶性小管萎缩，肾间质区域增宽，水肿，出现灶性纤维化，炎细胞呈片状-多灶性浸润。与模型组比较，防己黄芪汤组、去甘草组、蒙诺对照组明显减轻肾小管间质纤维化。见图1。
　　A:假手术组；B：模型组；C：防己黄芪汤组；
　　D：去甘草组；E：蒙诺对照组
　　图1 各组大鼠肾组织Masson染色(100倍)2．3 各组大鼠肾小管间质中α-SMA FN的表达 假手术组大鼠肾组织有极少量的α-SMA、Fn表达，而模型组大鼠肾小管细胞及间质出现大量阳性表达。药物干预后肾小管及间质α-SMA、FN表达明显下降。见图2～3。
　　A:假手术组；B：模型组；C：防己黄芪汤组；
　　D：去甘草组；E：蒙诺对照组
　　图2 各组大鼠肾组织α-SMA免疫组化梁色(100倍)A:假手术组；B：模型组；C：防己黄芪汤组；
　　D：去甘草组；E：蒙诺对照组
　　图3 各组大鼠肾组织Fn免疫组化梁色(100倍)2.4 各组肾组织α-SMA mRNA Fn mRNA表达 α-SMA mRNA Fn mRNA在造模后大鼠肾组织表达显著上调，与模型组比较，治疗组和蒙诺对照组表达显著降低，见图4。
　　注：与假手术组比较，△P≤0．05，▲P≤0．01，与模型组相比，
　　P≤0．01；与防己黄芪汤组比较，□P≤0.05。
　　图4 各组大鼠α-SMA Fn β-action mRNA的表达
　　(n=4，±s)3 讨 论防己黄苠汤是治疗肾病的著名经方之一，出自汉代名医张仲景著的《金匮要略》，在该书“痉湿喝病脉证并治专科第二”记载“风湿，脉浮、身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之。”又在“水气病脉证并治第十三”记述：“风水、脉浮、身重、汗出恶风者，防己黄芪汤主之。腹痛加芍药。”千百年来在医疗实践中获得疗效。近来研究发现防己黄芪汤还可改善慢性肾衰患者肾功能水平[4]，但在抗肾纤维化方面缺乏研究报道。实验采用经典的单侧输尿管结扎(UUO)致肾间质纤维化模型，结果显示，防己黄芪汤可显著降低UUO大鼠血尿素氮，使血白蛋白升高；肾小管间质纤维化程度亦较模型组显著减轻；同时，防己黄芪汤可使UUO大鼠肾小管和肾间质成纤维细胞标志蛋白α-SMA、细胞外基质的重要组成Fn的蛋白和基因表达显著降低，提示防己黄芪汤通过抑制α-SMA表达和Fn的产生，减轻肾间质纤维化。去甘草汤组与原方一样，改善了肾间质纤维化的多项指标，显著下降血尿素氮水平，提示防己黄芪去甘草汤可能有更优越的肾保护作用。现代药理研究发现甘草可与盐皮质激素受体结合发生醛固酮作用，出现水钠储留、低钾等症，而醛固酮是纤维化的重要致病因素之一，其受体拮抗剂则具有预防和减轻纤维化作用[5-6]。因此，这可能是去甘草组进一步改善肾功能、减轻肾间质纤维化的机理之一。近年来，屡有研究报道提示甘草有肾保护作用[7]，本实验与此不符。此与绝大多数研究是采用18-α甘草酸或以18-α甘草酸为主要成分的“甘草酸二胺”有关，而甘草的主要成分却是18-β甘草酸。本实验没有进一步发现加甘草与去甘草组间的统计学差异，这可能与本组实验周期较短，没有高剂量之间的比较有关，有待深入研究。血管紧张素转换酶抑制剂具有一定的抗肾纤维化作用，本研究采用血管紧张素转换酶抑制剂苯那普利(蒙诺)作为阳性对照，结果显示防己黄芪汤作用与蒙诺作用相似，但防己黄芪汤能升高UUO大鼠血白蛋白，蒙诺组血白蛋白无明显变化；去甘草组则较蒙诺组显著下降了血尿素氮，从另一个角度证实去甘草后的防己黄芪汤有更好的肾保护作用。
　　
　　参考文献
　　［1］ 屈燧林，方勤，陈高翔，等．汉防己甲素、川芎嗪和苦杏仁甙对人肾成纤维细胞的影响［J］.中华肾脏病杂志，2000，16(3)：186-188.
　　［2］ 陈清江，杨丽，王辉，等．黄芪对人肾间质成纤维细胞增殖和转化生长因子-β�1表达的影响［J］.郑州大学学报(医学版)，2005，40(5)：871-873．
　　［3］ 朱少铭，刘铭球，刘久波，等．木通与甘草合用对肾脏损伤的实验研究［J］.勋阳医学院学报，2002，21(5)：270-272．
　　［4］ 韩洪．防己黄芪汤加减治疗慢性尿酸性肾病32例观察［J］.北京中医，2004，23(3)：155-157.
　　［5］ Blasi ER,Rocha R,Rudolph AE,et al.Aldosteronelsalt induces renal inflammation and fibrosis in hypertensive rats［J］.Kidney Int,2003,63：1791-1800.
　　［6］ Feria I,Pichardo I，Juarez P，et al．Therapeutic benefit of spironolactone in experimental chonic cyclosporine A nephrotoxicit［J］.Kidney Int,2003,63：43-52．
　　［7］ 肖培根．新编中药志(第一卷)［M］．北京：化学工业出版社，2002：259-279.
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文