【ＴＧＦβ1与ＭＭＰ９及ＴＩＭＰ１在病毒性心肌炎心肌纤维化中的作用机制及清心Ⅱ号干预作用研究】 得了心肌炎怎么办

　　摘 要： 目的：探讨TGFβ1与MMP9及TIMP1在病毒性心肌炎心肌纤维化中的作用机制及清心Ⅱ号干预作用。方法：建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型后小鼠随机分为模型组、卡托普利治疗组、清心Ⅱ号高、中、低治疗组,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,治疗组分别给予卡托普利和清心Ⅱ号高中低剂量灌胃。疗程结束后分别采集心脏,应用RT-PCR技术检测CVB�3-RNA；免疫组化技术检测TGFβ1、MMP9及TIMP1。结果：造模后MMP9明显增高，TIMP1有下降趋势但不明显，TGFβ1明显增高，应用RT-PCR在心肌中可检测出病毒，清心Ⅱ号干预后MMP9 、TGFβ1减低，TIMP1有下降趋势，各治疗组病毒减少。结论：病毒、TGFβ1、MMP9及TIMP1在心肌纤维化形成中具有重要作用，清心Ⅱ号具有抗病毒、抗心肌纤维化作用。病毒性心肌炎慢性期的主要病理特征为心脏间质纤维化,临床病理表现为心脏顺应性下降,僵硬度增加,进而引起舒张功能障碍,可发展为DCM,同时也是顽固性心律失常、慢性心功能不全难以逆转、猝死的重要原因之一。由于病毒的持续存在，心肌不断损伤，最终导致心肌纤维化，但具体机制欠清，本实验从细胞因子角度阐述纤维化形成机理并进一步阐明清心Ⅱ号抗心肌纤维化的机制。
　　关键词：病毒：心肌纤维化；卡托普利；免疫组化；清心Ⅱ号
　　中图分类号：R542.21文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)05-1010-04
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　　Study on Effect of TGFβ1 MMP9 and Its Inhibitor 1 on Myocardial Fibrosis in Chronic Stage �of Viral Myocarditis and Interventional Treatment of QingXinⅡ
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　　LIU Wang，WANG Bao�qi，CHENG Zhi�qing，XU Bai�hong，WANG Juan�
　　（ZhejiangChinese Medical Univercity，Hangzhou 310053,Zhejiang,China）�
　　Abstract：Objective:TGFβ1 and MMP9 and TIMP�1 in viral myocarditis myocardial fibrosis mechanism and the role of intervention Qingxin Ⅱ.Methods:Establish mice model of myocardial fibrosis in chronic stage of viral myocarditis,then divide the mice model into model group,captopril group, QingXinⅡ high dose,medium dose and low dose group.The normal group and model group are given saline through stomach perfusing ,as well as the treated group are given respectively given captopril and QingXinⅡ high,medium and low dose in the same way.After the treatment ,hearts are collected,CVB3- RNA are detected by RT-PCR, TGFβ1MMP9 and TIMP1 are detected by immunohistochemical technique.Results:After having done the model,MMP9 has increased obviously;TIMP1 has the trend to decrease but not obvious; TGFβ1 has increased obviously;virus can be detected in the myocardium by RT-PCR;after the intervention of QingXinⅡ,MMP9 and TGFβ1 has decreased, TIMP1 has the tendency to decrease,virus has reduced in treated group.Conclusion:Virus, TGFβ1,MMP9 and TIMP1 have important effects in the formation of myocardial fibrosis; QingXinⅡ has the function of antivirus and anti-myocardial fibrosis.
　　Keywords:virus；myocardial fibrosis；captopril；immunohischemical technique；QingXinⅡ�
　　
　　1 材料及方法�
　　
　　1.1材料�
　　1.1.1 实验动物 健康雄性Balb/c小鼠，体重14～16g，购自中科院上海实验动物中心，浙江中医药大学动物实验中心饲养，动物质量合格证号: SCXK(沪)2003-0003，饲养于清洁动物房内，动物饲养设施条件合格证：SYXK(浙)2003-0003。 �
　　1.1.2病毒柯萨奇B3病毒(CVB3)(Nancy株,TCID50=10-7),由复旦大学附属中山医院病毒性心肌病重点实验室提供,本实验室-70℃低温冰箱保存。�
　　1.1.3 实验药物 清心Ⅱ号(人参、丹参、苦参组成，专利申请号01103287),高中低剂量每毫升含生药分别为：3、2、1g，水煎醇提，喷雾干燥，浙江中医药大学药学院制剂室提供。�
　　卡托普利片，国药准字H33020331，批号：0602102，25mg／片，浙江得恩德制药有限公司生产。�
　　1.1.4 试剂免疫组化检测试剂盒EnVision�TMTwo-Step Histostaining Reagent Lot: 00002568101，丹麦DAKO公司产品；MMP-9 AB19047，Rabbit来源的多克隆抗体，美国chemicon公司产品，Lot: 4017740710;TGF-β1为Rabbit来源的多克隆抗体Lot:8923100, 武汉博士德生物公司产品，BA0290；TIMP-1为Rabbit来源的多克隆抗体，Assay designs公司产品，905-584；Fibronectin，Mouse来源单克隆抗体，Labvision NeoMarkers公司产品；引物：上海Sangon生物工程技术公司合成，引物序列如下：coxsackie,上游TAACACACACCGATCAACAG,下游ATGGCCAATCCAATAACTAT,扩增产物大小为522bp;GAPDH,上游GAGGCCGGTGCTGAGTATGT,下游CTTCTGGGTGGCAGTGATGG,扩增产物大小为294bp；PCR试剂：购于大连宝生物工程有限公司。�
　　1.2 方法�
　　1.2.1 动物模型的制备及分组 健康、雄性Balb／C小鼠200只，习惯性饲养2天后，参照王振涛和前期[1-2]成功造模方法及预试验结果，随机分出正常对照组10只，腹腔接种不含病毒的 Eagle"s液，接种日期及次数同以下各组，其余首次腹腔接种内含CVB3TCID50=10-5的1∶2000病毒稀释液 0.2mL／只后常规饲养，14天腹腔接种1∶1600浓度 CVB3病毒液0.2rnL／只，28天后腹腔注射1∶800浓度 CVB3病毒液 0.2rnL／只，60天后成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型。随机选取90只，并随机分为5组：模型组10只，卡托普利组和清心Ⅱ号高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为17只。�
　　1.2.2 给药方法造模2个月后，清心Ⅱ号治疗组分别按高、中、低剂量：3、2、1g/kg灌胃（分别为成人剂量的30、20、10倍），卡托普利治疗组按45mg/kg（成人最大剂量的30倍）灌胃，模型对照组、正常对照组给予等量生理盐水灌胃，每日1次,疗程为45天。�
　　1.2.3 观察指标及检测方法 ①动物的一般情况（精神状态、活动度、皮毛光泽度、皮温及死亡情况）。
　　②心脏组织病理学观察：疗程结束后，小鼠活杀断头取心脏，滤纸吸干血迹，取心尖、右心室和室间隔部，放入预先消毒和DEPC处理过的冻存管，立即置于液氮中，用作RT-PCR实验；剩余部分心肌立即放在10%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定液中固定，石蜡包埋后常规连续切片，厚4μm，HE染色和VG特殊染色及免疫组化染色。
　　③免疫组织化学观察TGF-β1、MMP9、TIMP1染色：石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水10min，PBS洗，滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗；37℃孵育40min;DAB显色,封片。以PBS代替一抗作空白对照。利用HPIAS-1000病理图文分析系统半定量分析MMP9，TIMP1，TGFβ1蛋白水平的表达，即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采用HPIAS-1000病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集5个视野，经过该系统自动分析分别获得该5个视野的5个平均值（分别为：灰度值、积分光密度值、平均光密度值），经平均后代表该标本的染色强度，其中积分光密度值、平均光密度值代表该蛋白的表达强度，MMP9灰度值越小代表蛋白表达越强。
　　④RT-PCR方法检测CVB3RNA。
　　总RNA抽提及鉴定：心脏组织100mg，加1mL TRIzol，匀浆，分装1mL/每EP管，加氯仿1/5体积（0.2mL），4℃，离心12000g，15min，弃上清，加冰预冷75%乙醇（用DEPC水配）1mL，4℃离心7500g，5min，弃上清，溶于DEPC水中至20μL。�RNA纯度及浓度检测：抽提总RNA经琼脂糖凝胶电泳以鉴定，可见5S、18S和28S三条带,说明RNA完整没有降解，可作为逆转录反应的模板。取RNA抽提液2μL加98μL无RNA酶去离子水混匀，Du-640紫外分光光度仪测OD260/OD280，检测核酸浓度，计算核酸量。
　　逆转录反应:Eppendorf管中依次加入用TRIzol提取的总RNA11.5μL, 0.05μg/μL浓度的Oligo（dT）�152μL,70℃5min;再加入10mmol•L-1dNTP1μL,RNAase抑制剂0.5μL,M-MLV逆转录酶(200U/μL )1μL,5×M-MLV缓冲液4μL,42℃60min,95℃10min终止反应,4℃保存。
　　 聚合酶链反应:Eppendorf管中依次加入10×Taq Buffer缓冲液5μL,上下游引物各2μL,MgCl�2(25mM)4μL,Taq酶(5U/μL)0.5μL, dNTP(2.5mM) 4μL,DEPC水30.5μL。95℃预变性5min,94℃变性25s,58℃退火35s,72℃延伸15s,终末延伸7min, 35个循环，4℃保温。样本以基因GAPDH作为内参照，经1.5%琼脂糖凝胶（含EB）电泳，紫外光下拍照，电泳结果用Syngene成像分析系统（英国）进行扫描及灰度分析，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，以coxsackie和GAPDH条带吸光度积分的比值作为样本相对量。�
　　1.2.4统计学处理数据以(±s）表示,两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，均以P1表达
　　见表1。
　　
　　造模后模型组与正常组比，MMP9灰度值明显减低（P�0.05），TGFβ1明显增高（P�0.05），而TIMP1似有下降趋势，但无统计学意义（P�0.05）。经治疗后，MMP9灰度值清心Ⅱ号高、中剂量组、卡托普利组与模型组相比均有显著增高（P�0.05），而低剂量组与模型组相比增高不明显（P�0.05），卡托普利组增高显著，接近于正常组（与正常组相比P�0.05），清心Ⅱ号使MMP9灰度值增高与剂量关系不明显（P�0.05）；TIMP1治疗组似有增高趋势，但与模型组相比无统计学意义（P�0.05），低剂量组增高幅度低，与正常组有差距（P�0.05），其余治疗组接近于正常组（P�0.05），清心Ⅱ号治疗组增高幅度与卡托普利组相比无差别（P�0.05），低剂量组增高慢于中剂量组（P�0.05）；TGFβ1各治疗组较模型组均显著降低（P�0.05），清心Ⅱ号高、中剂量组接近于正常（与正常组比P�0.05），卡托普利组与低剂量组减低幅度较小（与正常组比P�0.05），清心Ⅱ号治疗组与卡托普利组比，疗效无差别（P�0.05），高中低三者亦无差异（P�0.05）；与模型组比较均有降低（P�0.05）（如图5～16）。�
　　
　　2.4 各组小鼠心肌内CVB3RNA表达水平情况�
　　
　　见表2。正常组未检测到CVB3。治疗后，清心Ⅱ号高、中剂量组、卡托普利组CVB3明显减少（P�0.05），低剂量组减少不明显（P�0.05）；高、中剂量组与卡托普利组无明显差异（P�0.05），卡托普利组比低剂量组CVB3减少显著（P�0.05）；清心Ⅱ号高、中剂量之间无差异（P�0.05），低剂量抑制病毒作用差。电泳结果见图17。�
　　
　　3 讨 论
　　
　　Petiyean J等[3]利用RT-PCR在患者心肌活检标本中也发现了肠道病毒 RNA，慢性病毒性心肌炎病毒持续感染已成共识，但病毒能长期存在于心肌的机制欠清，可能由于病毒RNA变异，不能合成衣壳蛋白，对复制方式为一种限制型或替代型，但由于病毒RNA仍可产生具有抗原特异性的非感染性病毒颗粒，即缺陷型病毒，足以导致进展性的心肌损伤，这种损伤包括病毒对心肌的直接损伤和免疫反应引起的心肌损伤[4-5]。损伤的心肌细胞及浸润的炎细胞释放TGFβ1并被活化，对成纤维细胞有强烈的趋化作用，同时诱导浸润细胞及常居细胞产生更多的TGFβ1，这种自我诱生放大的TGFβ1促使成纤维细胞分泌大量的细胞外基质。研究表明，成纤维细胞在TGFβ1的作用下，先合成大量的纤维连接蛋白，随后Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增多[6]。
　　TGFβ1作为一个关键性的生长因子在转录、转录后及翻译水平增加胶原等间质蛋白质的合成，并可通过抑制胶原酶等金属蛋白酶（MMPs）的分泌及刺激金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的表达而抑制胶原的降解，适时地增高表达是心肌损伤后修复的正常反应，若持续增高则导致心肌纤维化[7]。
　　本实验观察到TGFβ1模型组比正常组明显增高，MMP9灰度值表达与TGFβ1正好相反，其蛋白质表达增多，心肌反而发生纤维化，出现了矛盾现象，有学者认为全部胶原系统的含量是一个合成和降解的动态过程，基质蛋白降解产物可作为胶原合成的催化剂，使胶原纤维合成异常增长[8]。基质组分的降解是基质重构的重要基础，MMPs不仅通过直接降解ECM参与纤维化和重构过程,而且还可以通过调节基质因子的形成及影响生物活性分子从ECM的释放参与这一过程。其中基质因子如甘氨酰-组氨酰-赖氨酸是基质蛋白的肽链片断,可调节结缔组织细胞活性,促进成纤维细胞合成胶原[9]；而TGFβ1可在MMPs等蛋白水解酶的作用下从ECM释放，从而作用于胶原合成过程[10]。因此在纤维化过程中，MMPs活性的增强可能会使胶原合成增多,进而引起纤维化的加重。�MMP9（明胶酶）因其降解明胶及其它特性而备受关注。明胶酶还能有效分解间质胶原[11]，因为其能启动纤维胶原的降解过程，目前认为明胶酶在细胞外基质重塑及心肌纤维化过程中具有十分重要的作用[12]。TIMP1由巨噬细胞和结缔组织细胞产生[13],TIMP1强烈抑制除MMP2、MT1-MMP外的多数MMPs，因其是可溶性的，与所有的MMPs可结合，发挥抑制其活性的作用[14]。MMP9与TIMP1结合形成复合物，TIMP1抑制MMP9的活性，正常处于动态平衡。实验表明，虽然TIMP1量很小，变化范围有限，但也对MMP9具有明显的抑制作用。但二者之间的具体作用机制尚不清楚。
　　本实验同时观察到，CVB3病毒是引起心肌纤维化的关键因素，通过反复增量腹腔注射病毒复制的慢性心肌炎心肌纤维化模型，各组小鼠心肌中均检测到CVB3病毒，治疗组各组小鼠的病毒含量均减少，病毒含量与心肌纤维化呈正相关。因此，抗病毒是治疗病毒性心肌炎心肌纤维化的首要方法。
　　清心Ⅱ号（由人参、丹参、苦参组成）抑制病毒呈剂量依赖关系，高、中剂量组病毒得到有效抑制，卡托普利对照组对病毒亦有明显抑制作用，而现有资料未见报道有直接抗病毒作用，但该组病毒量亦显著减少，其作用机制可能与调整免疫反应有关[12]，使病毒量相应减少。
　　清心Ⅱ号（由人参、丹参、苦参组成）是长期应用于心肌炎临床治疗的行之有效的方剂，方中人参具有益心气养心阴作用，苦参能清热解毒，丹参活血化瘀。现代药理学研究证实：人参、苦参、丹参均具有清除氧自由基作用，人参、苦参对柯萨奇B组病毒等均有抑制和杀灭作用[15]。丹参可促进SOD的产生,具抗氧化、抗自由基的作用,从而能保护心内皮细胞以及心肌细胞,预防氧自由基导致的心肌细胞变性、坏死及成纤维细胞增殖,从而预防和逆转心肌纤维化[16]。合方具有良好抗病毒、抑制心肌纤维化作用，值得继续深入研究。�
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